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      翌圣超潔凈低殘留T4 DNA聚合酶，助力mNGS精準(zhǔn)檢測(cè)！
       
      

      病原宏基因組學(xué)（mNGS）不依賴傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)，可直接高通量測(cè)序，能夠快速、無(wú)偏差的檢測(cè)臨床樣本中的全部病原，適用于急危重癥和疑難感染的診斷。mNGS的整體檢測(cè)流程包括核酸提取、文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序、生信分析與報(bào)告解讀部分。
      

      


      

      

      


      

      圖1. 臨床實(shí)驗(yàn)中mNGS整體工作流程[1]
      


       
      


      T4 DNA聚合酶作為mNGS檢測(cè)中的關(guān)鍵酶之一，發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，不在實(shí)驗(yàn)中引入背景菌污染，在一定程度上利于mNGS檢出率的提升。翌圣經(jīng)過匠心研發(fā)，開發(fā)出高性價(jià)比的超低殘留產(chǎn)品UCF.ME® T4 DNA Polymerase，接下來(lái)小翌將圍繞該酶的作用方式、應(yīng)用場(chǎng)景、性能展示等方面進(jìn)行介紹。
      


      

       
      

      

      


      

      

      

      

      

      什么是T4 DNA聚合酶
      

      

      

      

      

      


      

      T4 DNA聚合酶(T4 DNA Polymerase) ，是一種模板依賴的DNA聚合酶，可以結(jié)合在有引物的單鏈DNA 模板上，從5' →3'方向催化DNA合成反應(yīng)。T4 DNA Polymerase具有3' →5'外切酶活性，但不具有5' →3'外切酶活性，可以用于將DNA黏性末端的平滑化，也就是5'突出末端補(bǔ)平或3'突出末端削平。
      

      


      

      

      


      

      圖2. T4 DNA Polymerase作用方式
      


       
      

      


      

      

      

      

      

      T4 DNA聚合酶的應(yīng)用
      

      

      

      

      

      


      

      T4 DNA聚合酶由于可以將DNA黏性末端平滑化的特性，常被應(yīng)用在DNA建庫(kù)、RNA建庫(kù)、分子克隆等技術(shù)中，可應(yīng)用于生物研究、腫瘤檢測(cè)、感染性疾病等研究領(lǐng)域。其中，以DNA樣本類型為例了解mNGS文庫(kù)構(gòu)建基本流程：
      

      


      

      

      

      

      

      DNA建庫(kù)
      

      

      

      

      

      


      

      文庫(kù)構(gòu)建實(shí)質(zhì)上是將片段化后的DNA兩端加上通用接頭序列，通過PCR擴(kuò)增獲取足夠多能夠上機(jī)測(cè)序的文庫(kù)核酸分子。在DNA文庫(kù)構(gòu)建過程中，TA克隆連接接頭建庫(kù)是目前商業(yè)技術(shù)中最常用的技術(shù)手段，主要建庫(kù)流程如下：
      

      


      

      

      


      

      圖3. DNA建庫(kù)流程
      


      

       
      

      


      DNA片段化：由于目前市場(chǎng)中測(cè)序儀的測(cè)序長(zhǎng)度通常在150-500bp之間，因此需要使用機(jī)械打斷或酶切打斷的方法將大片段基因組DNA進(jìn)行片段化。
      


      

       
      

      


      末端修復(fù)，3'端加“A”：打斷后的DNA會(huì)產(chǎn)生黏性末端以及平末端，而所有的黏性末端都需要轉(zhuǎn)為平末端，T4 DNA聚合酶可以將這些3'突出末端切平、5'突出末端補(bǔ)平，最終將含黏性末端的DNA片段轉(zhuǎn)變?yōu)槠侥┒薉NA。
      


      

       
      

      


      接頭連接：接頭是文庫(kù)中的重要組成部分，測(cè)序中常用的Illumina平臺(tái)Y型接頭， T4 DNA連接酶可將帶有“T”黏性末端的接頭和帶“A”黏性末端的DNA片段連接起來(lái)形成一個(gè)完整的雙鏈。
      


      

       
      

      


      PCR富集：通過PCR反應(yīng)獲取到足夠多帶接頭的DNA序列，上機(jī)完成對(duì)樣本核酸序列的測(cè)序。
      


      

       
      

      


      雖然mNGS具有更高的敏感性，但是mNGS檢測(cè)的各個(gè)環(huán)節(jié)都可能引入內(nèi)、外部來(lái)源的核酸污染。其中，減少試劑污染對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的負(fù)面影響，對(duì)于識(shí)別真正的目的病原體至關(guān)重要。
      


      

       
      

      


      翌圣生物已經(jīng)建立了超低殘留酶的生產(chǎn)工藝，UCF.ME® T4 DNA Polymerase具有超低殘留、高純度的特點(diǎn)，可以有效在實(shí)驗(yàn)中減少因背景菌導(dǎo)致的負(fù)面影響，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
      


      

       
      

      

      


      

      

      

      

      

      性能展示
      

      

      

      

      

      


      

      1.超低宿主殘留，與進(jìn)口品牌E*相當(dāng)：30 U＜3 copies
      

      


      

      

      


      

      圖4. 使用qPCR方法檢測(cè)大腸桿菌基因組殘留：Yeasen-1、Yeasen-2、Yeasen-3分別為3個(gè)不同的生產(chǎn)批次，結(jié)果均30U<3 copies。
      

      


      

      2.高純度：＞95%
      

      


      

      

      


      

      

      圖5. 從左至右依次是在同批次同濃度不同體積下 (2 µL、4 µL、6 µL) UCF.ME® T4 DNA聚合酶的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，其純度＞95%。
      


       
      

      

      


      

      

      

      

      

      產(chǎn)品訂購(gòu)
      

      

      

      

      

      


      

      
	
		
      
			
			
      產(chǎn)品定位
      
			      		
			
			
      產(chǎn)品名稱
      
			      		
			
			
      產(chǎn)品貨號(hào)
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      超低殘留高純度T4 DNA聚合酶
      
			      		
			
			
      UCF.ME® T4 DNA Polymerase 
      

			
      (3 U/μL) T4 DNA聚合酶(3 U/μL)
      
			      		
			
			
      14457ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      末修加A
      
			      		
			
			
      T4 DNA Polymerase(5 U/μL) T4 DNA聚合酶(5 U/μL)
      
			      		
			
			
      12901ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      T4 Polynucleotide kinase(10 U/μL) 
      

			
      T4多聚核苷酸激酶(10 U/μL)
      
			      		
			
			
      12902ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      接頭連接
      
			      		
			
			
      Hieff® Quick T4 DNA Ligase
      
			      		
			
			
      10301ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      rRNA去除/cDNA二鏈合成
      
			      		
			
			
      RNase H 核糖核酸酶H
      
			      		
			
			
      12906ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      rRNA去除
      
			      		
			
			
      Recombinant DNase I (RNase-free)
      
			      		
			
			
      10325ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      cDNA合成
      
			      		
			
			
      Murine RNase Inhibitor(40 U/µL) 鼠源RNase抑制劑
      
			      		
			
			
      10603ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      DNA polymerase I DNA聚合酶I
      
			      		
			
			
      12903ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      宏基因組建庫(kù)DNA建庫(kù)試劑盒
      
			      		
			
			
      Hieff NGS® OnePot Ⅱ DNA Library 
      

			
      Prep Kit for Illumina® 極速RNA 建庫(kù)試劑盒
      
			      		
			
			
      13490ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      宏基因組建庫(kù)RNA建庫(kù)試劑盒
      
			      		
			
			
      Hieff NGS® Fast RNA Library 
      

			
      Prep Kit for Illumina® 極速RNA 建庫(kù)試劑盒
      
			      		
			
			
      12304ES
      
			      		
		
      
	      

      

      


       
      


      

      

      

      

      

      參考文獻(xiàn)
      

      

      

      

      

      


      

      1. Han D, Li Z, Li R, Tan P, Zhang R, Li J. mNGS in clinical microbiology laboratories: on the road to maturity. Crit Rev Microbiol. 2019 Sep-Nov;45(5-6):668-685.
      


      2. Li N, Cai Q, Miao Q, Song Z, Fang Y, Hu B. High-Throughput Metagenomics for Identification of Pathogens in the Clinical Settings. Small Methods. 2021 Jan 4;5(1):2000792.
      


      3. Frey MW, Nossal NG, Capson TL, Benkovic SJ. Construction and characterization of a bacteriophage T4 DNA polymerase deficient in 3'-->5' exonuclease activity. Proc Natl Acad Sci USA. 1993;90:2579–2583.
      

      

       
       
       
       
       
       
       
      400-6111-883