抗體二抗
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選擇HRP(辣根過(guò)氧化物酶)、堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗 |
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熒光WB可自行選擇對(duì)應(yīng)的熒光素標(biāo)記二抗 |
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A. HC(免疫組織化學(xué))使用小鼠抗HCN1單克隆抗體 對(duì)小鼠小腦的免疫組化分析. 固定:室溫下10% 福爾馬林溶液處理12-24小時(shí). 一抗:小鼠抗HCN1單克隆抗體,1:1000,室溫下孵育1小時(shí). 二抗:HRP/DAB 檢測(cè)系統(tǒng):生物素偶聯(lián)的山羊抗小鼠,鏈霉親和素過(guò)氧化物酶,DAB 色原(棕色),室溫下孵音30分鐘. 復(fù)染色:Maver氏蘇木素(紫色/藍(lán)色) 細(xì)胞核染色,250-500uL,室溫下5分鐘. |
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B.ICC(免疫細(xì)胞化學(xué))使用小鼠抗Hsp70單克隆抗體對(duì)小鼠熱休克的黑素瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)分析. 固定:福爾馬林. 一抗: 小鼠抗Hsp70單克隆抗體,1:1000,室溫下隔夜孵育. 二抗: Biotin山羊抗小鼠 圖片來(lái)自: Dr, Ewa Malusecka,Maria Sklodowska-Curie Memorial Cancer Ceter and Inst. Of Oncology, Poland. |
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C.IHF(免疫組織熒光)使用小鼠抗Neuroligin 4單克隆抗體對(duì)小鼠齒狀回的免疫組織熒光分析. 固定:甲醛固定石蠟包埋。 一抗: 小鼠抗Neuroligin 4單克隆抗體,1:100. 二抗: FITC 山羊抗小鼠(綠色). 復(fù)染色: DAPI(藍(lán)色) 細(xì)胞核染色,1:1000. 圖片來(lái)自: Rachel Reith, NIH/NIMH. |
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D.ICF(免疫細(xì)胞熒光)使用小鼠抗HO-1單克隆抗體對(duì)人HeLa Cels的免疫細(xì)胞熒光分析. 固定:室溫下2% 甲醛處理20分鐘. 一抗: 小鼠抗HO-1單克隆抗體,1:100,4℃下孵育12小時(shí). 二抗: FITC 山羊抗小鼠 (綠色),1:200,室溫下孵育2小時(shí). 復(fù)染色: DAPI(藍(lán)色) 細(xì)胞核染色,1:40000,室溫下2小時(shí). 染色定位: 微粒體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),低氧時(shí)定位至細(xì)胞核. 放大倍數(shù): 100x. |
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通常用二抗是用免疫球Fc,Fab片段免疫制備如IgG( H&L)，這類(lèi)抗體和lgG分子的重鏈和輕鏈都可以反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中為避免重輕鏈干擾可選擇只用Fc或者只用fab免疫的二抗，從而避開(kāi)重鏈(大小約55KDa)輕鏈(大小約25KDa)干擾. |
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F(ab')2片段形式的二抗可避免與Protein A/G或與Fc受體的結(jié)合，其分子本身比較小，更容易滲透入細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)內(nèi)而靈敏度更高。 |
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Fab片段形式的二抗是只含有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，可用來(lái)封閉內(nèi)源性的免疫球蛋白;它是最常用也是性?xún)r(jià)比最高的二抗形式，這類(lèi)抗體和laG分子的重鏈和輕鏈都可以反應(yīng)，也可以和其他的免疫球蛋白家族(IlqM，IgA，lgD,IgE)和亞家族反應(yīng)，因?yàn)樗械拿庖咔虻鞍锥加邢嗤妮p鏈. |
