1. A260/280比值較低？或者A260/280比值較高？

用水作為洗脫液比較偏低，或者蛋白質(zhì)殘留，但如果操作過程中使用了苯酚，則更可能是苯酚殘留。而比較高可能是大量RNA殘留，沒有使用RNaseA，或RNaseA活性下降。

2. 提取的細(xì)菌基因組DNA有降解，為什么？

確認(rèn)選用的培養(yǎng)菌體是否新鮮，如果菌體需要保存時(shí)，請(qǐng)于-80℃保存。

起始菌液量過多，導(dǎo)致菌液裂解不充分，部分DNA降解。

菌體本身富含DNA酶活性，加入Digestion solution后再加20ul 0.5M EDTA溶液來抑制內(nèi)源性核酸酶

3.提取的基因組DNA生物活性差，為什么？

提取的基因組DNA中鹽分濃度過高，請(qǐng)嚴(yán)格按照說明書操作。

提取的基因組DNA中含有乙醇。離心的速度和時(shí)間應(yīng)該嚴(yán)格遵循說明書要求進(jìn)行。

4.堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定時(shí)，看到的三條帶分別是什么？

堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，得到的三條帶是以電泳速度的快慢排序的，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。

5. 為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戊醇？

在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

1. 凍存細(xì)胞與新鮮細(xì)胞的RNA提取有區(qū)別嗎？具體該怎么操作？

新鮮細(xì)胞與凍存細(xì)胞RNA提取沒什么區(qū)別。直接把Trizol直接加到凍存管了，一起化開，振蕩振蕩就可以了。與從組織中提RNA 差不多。

2. RNA得率低

• 有的組織或者細(xì)胞中RNA含量偏低：不同細(xì)胞和組織中RNA的豐度不同，如肝臟，胰腺，心臟等是高豐度組織(總RNA含量2-4μg/mg)，腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢等是中豐度組織(總RNA含量0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低豐度組織(總RNA含量<0.05μg/mg)。

• 組織起始量太少或者太多：樣品量過少，則細(xì)胞組織中RNA含量較低；樣品量過多則可能超過裂解液的裂解能力，裂解將不完全，從而導(dǎo)致RNA得率低。

3. RNA降解

• 提取的材料不新鮮。新鮮組織取得后應(yīng)立即置于液氮中或立即放入RNAstore試劑中，以保證提取效果。

• 處理樣品量過大。

• 污染了RNase。雖然試劑盒中提供的緩沖液都不含RNase，但使用過程中很 容易污染RNase，應(yīng)小心操作。

4. OD260/OD280比值偏低

• 蛋白質(zhì)污染/苯酚殘留：用Triol提取時(shí)確保不要吸入中間層及有機(jī)相。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，則用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。

• 多糖或多酚的殘留：一些特殊的組織和植物中，多糖、多酚含量較多，這些殘留也會(huì)導(dǎo)致OD260/OD280比值偏低。因此，從這類材料中提取RNA時(shí)，需要注意多糖、多酚雜質(zhì)的去除。

• 設(shè)備限制：測(cè)定OD260及OD280數(shù)值時(shí)，要使OD260讀數(shù)在0.1-0.5之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測(cè)OD值時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用10mM Tris，pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值偏低。

   

5. RNA中有基因組DNA污染

• 材料中核酸含量高：脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高，可進(jìn)行多次酚/氯仿抽

• 提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 處理，降解 DNA。

• 材料過量：增加試劑用量。

• RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例偏高。

• 溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。