核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)指能水解核糖核酸（RNA）磷酸二酯鍵的酶，是具有催化功能的核酸內(nèi)切酶，反應(yīng)產(chǎn)物為單核苷酸和寡核苷酸。

RNase是一類普遍存在的酶，真核生物、古細(xì)菌和細(xì)菌中至少存在21種類型的RNA酶，在基因表達(dá)和調(diào)控、基因組復(fù)制和維持、宿主防御、應(yīng)激反應(yīng)、病毒感染等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，RNase能改變宿主細(xì)胞新陳代謝，抑制病毒合成，在體外能抑制流感病毒增殖，在雞胚內(nèi)能抑制痘苗、皰疹病毒形成。

RNA酶家族包括RNase A、RNase T1和RNase H等。其中，RNase A是使用最為廣泛的一種核糖核酸酶，最初是從牛胰腺中發(fā)現(xiàn)，可在胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)殘基處特異性降解單鏈RNA。RNase A在多種反應(yīng)條件下均具有活性，可以切割單鏈RNA、雙鏈RNA以及RNA-DNA雜交體中的RNA鏈。

RNase不僅廣泛存在于原核和真核生物的組織和細(xì)胞中，就連實驗環(huán)境和許多生物材料中也無一例外。實驗室中RNase污染的來源主要包括外源性和內(nèi)源性兩種。常見的外源性污染源有：實驗用水與緩沖液、槍頭與離心管、酶及其他相關(guān)試劑和耗材等；實驗大環(huán)境的污染，如空氣、灰塵和大多數(shù)物體的表面；實驗人員的毛發(fā)、皮膚碎屑、汗液和唾液等。內(nèi)源性污染源則是指生物樣品中含有的內(nèi)源性RNase。

已知RNase能夠催化RNA降解為單核苷酸，且RNA樣本中微量的RNase污染也足以導(dǎo)致其完全降解，從而導(dǎo)致有價值的樣本丟失或干擾實驗。小到研發(fā)階段的單個實驗操作、實驗室環(huán)境，大到生產(chǎn)階段的商品化試劑、商業(yè)化制劑等，都極易發(fā)生RNase污染。RNase污染會迅速降解實時熒光定量PCR、cDNA克隆和mRNA合成研發(fā)等實驗中的重要樣本，導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)丟失以及研發(fā)的時間成本和費用成本損耗等。因此，RNase污染的檢測是分子實驗室環(huán)境、實驗試劑和生物制品的制備等各個環(huán)節(jié)都需要進(jìn)行的檢項。

RNase污染可以從源頭預(yù)防，一方面嚴(yán)格控制外源性RNase污染，另一方面最大限度地抑制內(nèi)源性的RNase。控制外源性RNase污染的方法：操作人員全副武裝，實驗戴手套，且觸摸門把手、普通物體表面后更換手套；使用專業(yè)儀器與試劑，盡量使用RNase-free的試劑和耗材；選擇RNase-free的實驗操作環(huán)境等?？刂苾?nèi)源性RNase污染的方法：樣本保存方面，獲取樣本后若不直接提取RNA，要及時用液氮冷凍存于-80℃，并盡早開展實驗，使RNA的降解最小化；添加抑制劑方面，在細(xì)胞裂解液中加入RNase抑制劑，最大限度地降低細(xì)胞破碎過程中所釋放的RNase的活性。

隨著生物制藥行業(yè)的快速發(fā)展，國家對生物制品的質(zhì)量安全性管控也更加嚴(yán)格。與此同時，包含新興的mRNA疫苗研究等在內(nèi)的生物醫(yī)藥研發(fā)型和服務(wù)型企業(yè)，在藥物開發(fā)和生產(chǎn)過程中也越來越重視質(zhì)量把控。

由于RNase無處不在，并且會降解RNA，對許多涉及RNA的研究造成影響。因此，在研發(fā)與生產(chǎn)過程中，對外來物料、耗材和環(huán)境等進(jìn)行RNase殘留檢測成為了關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)。

通過對文獻(xiàn)、法規(guī)等的調(diào)研發(fā)現(xiàn)：RNase具體檢測方法在《中國藥典2020版》、《USP43》和《EP10》等文件中尚無明確規(guī)定。

目前，常見的RNase污染檢測方法主要有：核酸水解-紫外分光光度法、核酸水解-凝膠電泳法、高效液相色譜(HPLC)和電化學(xué)法等。前兩種方法均存在檢測靈敏度偏低、操作繁瑣、通量偏低等缺陷，后兩種方法存在耗時費力和受限于儀器設(shè)備等缺陷。

通常研發(fā)和生產(chǎn)環(huán)境以及原料中RNA酶的殘留量處于一個未知狀態(tài)，而研發(fā)與生產(chǎn)的進(jìn)度和品控又需要同時兼顧，這就對RNase檢測方法的靈敏度和時效性提出了要求，常見的檢測方法很難達(dá)到預(yù)期效果。

針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了RNase活性檢測試劑盒，用于測定待測樣本體系整體的RNase殘留，滿足mRNA領(lǐng)域質(zhì)量安全控制的需求。本試劑盒采用底物熒光標(biāo)記法，使用一種新型RNA底物，其一端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。加入待測樣本后，若樣本無RNase污染，則不會產(chǎn)生熒光信號；若有RNase污染，則熒光標(biāo)記的RNA底物被水解，從而產(chǎn)生逐漸增強(qiáng)的熒光信號。

檢測方法多樣：可根據(jù)實際情況進(jìn)行定性或定量檢測；

符合法規(guī)：按照法規(guī)要求進(jìn)行全面驗證，可提供驗證報告；

靈敏度高：檢出限低至可測0.5pg的RNase A；

專屬性強(qiáng)：特異性檢測RNase含量，不受DNase干擾；

抗干擾強(qiáng)：RNA底物對高低pH和高鹽背景溶液耐受能力強(qiáng)

試劑盒可檢測具備活性的RNase A濃度范圍為：50pg ~ 0.5pg（100μL體系），R2≥0.98，各濃度檢測值CV＜15%。

圖1. RNase活性檢測試劑盒動力曲線和在2min時的標(biāo)準(zhǔn)曲線

[1]國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心.新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）.2020.

[2]USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccines–Draft. 2022.

[3]Thermo scientific RNase A(DNase and Protease-free).

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工作人員收到信息后，會在2天內(nèi)審核，并在5個工作日內(nèi)派發(fā)產(chǎn)品。