CAR-T細胞療法是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究最前沿和熱門的方向之一，該法已在白血病，淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤等癌癥的臨床實驗中獲得巨大成功，為癌癥治療打開了新格局，為患者的健康提供新方向。

圖1.CAR-T細胞治療流程示意圖（參考文獻）

CAR-T細胞生產(chǎn)和制備過程中，需將特定CAR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至T細胞的病毒載體上，因此高質(zhì)量的慢病毒載體的生產(chǎn)是GMP生產(chǎn)過程中極為重要的環(huán)節(jié)。為對慢病毒載體進行精準(zhǔn)分析和產(chǎn)品質(zhì)量控制，中國國家藥監(jiān)局藥品審評中心(CDE)發(fā)布的《CAR-T細胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測研究及非臨床研究考慮藥典》和《基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》等相關(guān)指導(dǎo)原則指出，建議對慢病毒載體進行滴度檢測，其中免疫分析法(ELISA)是行業(yè)內(nèi)檢測慢病毒物理滴度的首選方法，病毒載體顆粒數(shù)量即p24抗原含量。HIV-1 p24 ELISA檢測試劑盒用于檢測HIV-1的慢病毒中p24蛋白含量。

HIV-1 Gag蛋白是一種晚期結(jié)構(gòu)蛋白，包括四種蛋白：基質(zhì) (p17)、衣殼 (p24)、核衣殼 (p7) 和 p6 蛋白。P24是結(jié)構(gòu)基因Gag的產(chǎn)物，是HIV病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的包裝和成熟過程中起到十分重要作用。P24蛋白的氨基酸序列在HIV中高度保守，若缺失p24會導(dǎo)致病毒無法成功正常組裝。

圖2.HIV病毒顆粒示意圖（圖片來自網(wǎng)絡(luò)）

p24抗原檢測可實現(xiàn)慢病毒產(chǎn)品質(zhì)控要求，通過滴度計算，一個慢病毒顆粒（Lentiviral Particle，LP）約含有2×103個P24蛋白分子，1ng含量的p24為1.25×107LPs（≈1.25×10^4-5TU），即正常情況下，每100-1000LPs中含有1個具有感染活性的病毒載體，即1個TU。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品實驗數(shù)據(jù)通過四參數(shù)擬合方式擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3.HIV-1 p24 ELISA Kit標(biāo)曲數(shù)據(jù)與示意圖

板內(nèi)精密度：3個不同加標(biāo)濃度樣本分別在同一板子上檢測8次，擬合板內(nèi)差異，變異系數(shù)均值為4.6%，重復(fù)性較好；

板間精密度：3個不同加標(biāo)濃度樣本分別在統(tǒng)一批次的3個板上檢測20次，擬合板間差異，變異系數(shù)均值為6.0%，重復(fù)性較好。

表1.HIV-1 p24 ELISA Kit精密度數(shù)據(jù)

分別在3份以上正常人血清，人血漿和培養(yǎng)基等多樣本下，添加梯度濃度的重組人血清白蛋白，擬合計算加標(biāo)回收率，均在80-120%范圍。

表2.HIV-1 p24 ELISA Kit各樣本加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)

分別在3份以上正常人血清，人血漿和培養(yǎng)基等多樣本下，添加重組人血清白蛋白做稀釋線性，擬合計算稀釋線性數(shù)據(jù)，均在正常范圍內(nèi)。

表3.HIV-1 p24 ELISA Kit各樣本稀釋線性數(shù)據(jù)

靈敏度：重復(fù)檢測20次零孔OD值，計算相應(yīng)的濃度來確定人血清白蛋白的最低檢測劑量為2.7 pg / mL。

試劑盒內(nèi)各耗材均通過37℃放置加速實驗驗證，變異系數(shù)于7天加速值為95%，擬合標(biāo)曲穩(wěn)定正常，確定其加速穩(wěn)定性效果較好。

圖4.HIV-1 p24 ELISA Kit加速穩(wěn)定性示意圖

翌圣生物自研產(chǎn)品HIV-1 p24蛋白檢測試劑盒適用于CAR-T質(zhì)控，相關(guān)疾病檢測研究和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率檢測等領(lǐng)域的科研蛋白定量，以期助力研究工作對機制研究和潛在臨床價值的探索。產(chǎn)品在上市前均嚴(yán)格質(zhì)檢，確保研究檢測準(zhǔn)確性。

Barrett D M ,  Singh N ,  Porter D L , et al. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer[J]. Annual Review of Medicine, 2013, 65(1).