環(huán)狀 RNA (circRNA)是一類單鏈閉合的環(huán)狀RNA分子，與線性mRNA相比，circRNA具有穩(wěn)定性高、免疫原性低、表達(dá)持久等優(yōu)勢，已經(jīng)成為下一代RNA療法賽道的新秀。將IVT得到的線性RNA進(jìn)行環(huán)化是circRNA人工合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，常用的環(huán)化策略包括Ⅰ型內(nèi)含子自剪切、Ⅱ型內(nèi)含子自剪切和T4 RNA連接酶策略。連接酶策略中最常用的便是T4 RNA Ligase 1。

圖1. T4 RNA Ligase 1環(huán)化機(jī)理

T4 RNA Ligase 1是一種ATP依賴型連接酶，可以催化單鏈RNA、單鏈DNA、單核苷酸分子間或分子內(nèi)的5'-P末端與3'-OH末端之間形成磷酸二酯鍵。翌圣的T4 RNA Ligase 1由大腸桿菌重組表達(dá)，連接效率高，核酸酶殘留水平低，可用于RNA與RNA分子間連接/分子內(nèi)連接（RNA環(huán)化）、miRNA文庫構(gòu)建中的5'端接頭的連接、5'-RACE (cDNA末端快速擴(kuò)增)中將寡核苷酸連接到單鏈cDNA中等應(yīng)用。

圖2. T4 RNA Ligase 1連接類型示意圖

圖3. 切口酶殘留檢測

將30 U翌圣及進(jìn)口品牌N*的T4 RNA Ligase 1與底物DNA孵育，瓊脂糖凝膠電泳比較DNA譜帶變化。結(jié)果顯示翌圣3個(gè)批次的T4 RNA Ligase 1切口酶殘留顯著低于進(jìn)口品牌N*。

圖4. 外切酶殘留檢測

圖5. RNase殘留檢測