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      干貨|翌圣核酸提取寶典,建議先收藏!

       
       
      核酸作為一切分子生物學研究的基礎,而且提取的核酸質(zhì)量高低也是決定下游實驗成敗的關鍵因素之一。磁珠法提取和硅膠膜離心柱法提取是最常用的兩種提取方法。那么,這兩種提取方法各有什么特點?提取流程與原理又是什么呢?核酸提取過程中的常見問題有哪些呢?
       
       
       

      硅膠膜離心柱法核酸提取原理

      硅膠膜表面的硅醇基團呈弱酸性,其水化后帶負電。當溶液中存在一定濃度的陽離子后,形成的陽離子橋能夠中和DNA和硅醇基團之間的表面負電荷,從而使DNA牢固地吸附在硅膠膜表面。反之,處于低鹽水溶液狀態(tài)下時,由于硅膠膜的硅醇基團與DNA磷酸基團之間的靜電排斥,硅膠膜釋放DNA。
       
      流程

       
      特點
      • 實驗流程操作簡單;
      • 價格低廉;
      • 提取濃度濃度高,純度高。

       

      磁珠法核酸提取原理

      運用納米技術,對超順磁性納米顆粒的表面進行表面修飾制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。核酸結合到磁珠上主要依靠靜電作用、疏水作用和氫鍵作用。在鹽離子和外加磁場的作用下,能從樣本中分離出核酸,并洗去非特異性吸附的雜質(zhì),得到純化后的核酸。

       

       
      流程

       
      特點
      • 能夠?qū)崿F(xiàn)自動化、大批量的實驗操作;
      • 操作簡單,用時短,如新冠病毒核酸提取10分鐘內(nèi)可以完成;
      • 安全無毒,符合環(huán)保理念。

       

      核酸提取常見的問題及解決方案

      問題一: A260 / A280異常是什么原因呢?
       
       

      A260 / A280比值應大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。

      • DNA提取中RNA 污染會增高260/280比值;

      • RNA提取中RNA降解會增高260/280比值;

      • 蛋白的污染會降低A260 / A280比值。

       

      問題二:A260/A230異常是什么原因呢?
       
       
      • 較純凈的核酸A260/A230的比值一般在1.8-2.2之間;

      • 酚、胍鹽、蛋白的污染會降低A260/A230的比值;

      • 當樣本核酸濃度太低時,A260/A230結果不準確,會導致比值偏低;

      • 當樣本濃度低于50ng/µl,A260/ A280、A260/ A230比值波動非常大,應謹慎對待!

       

      問題三:提取的基因組DNA生物活性差,為什么?
       
       
      • 提取的基因組DNA中鹽分濃度過高,請嚴格按照說明書操作;

      • 提取的基因組DNA中含有乙醇。離心的速度和時間應該嚴格遵循說明書要求進行。

       

      問題四、質(zhì)粒提取時出現(xiàn)細菌基因組的污染是怎么回事呢?
       
       
      • 菌體裂解和中和過程中,劇烈混合造成基因組DNA斷裂所致。請溫和地進行菌體的裂解和中和;

      • 每一步嚴格按照說明書的操作時間;

      • 細菌的質(zhì)量差,中有許多斷裂或降解而游離的基因組DNA,請使用生長良好的新鮮細菌。

       

      問題五:磁珠法提取時,洗脫液中有磁珠有殘留怎么辦?
       
       
      • 篩選、選擇匹配的磁珠;
      • 調(diào)節(jié)設備,增強外磁場;
      • 放慢磁介入速度并延長磁吸時間。

       

      問題六:洗滌洗脫時磁珠有結塊怎么辦?
       
       
      • 縮短干燥時間;

      • 增強混勻震蕩強度。

       

      問題七:增加磁珠量是否可以提高核酸得率?
       
       

      NO!通常情況下,磁珠法試劑盒給出的參考磁珠用量都是略微過量的。

      • 過多的磁珠將無法均勻分散于液體中;

      • 過量的磁珠會吸附更多的雜質(zhì);

      • 過多的磁珠會吸附蛋白酶、溶菌酶等功能成分,導致整個提取效率降低。

       

      問題八:一種磁珠是否適配所有的核酸提取體系?
       
       

      NO!于不同磁珠適合的體系和用量是不同的,往往需要調(diào)整后才能獲得更好的提取效果。

      • 有的磁珠適合偏酸性系列的試劑體系,有的適合偏堿性系列的試劑體系;

      • 有的磁珠磁響應性好但是沉降速度快,更適合磁棒式自動提取儀;

      • 有的磁珠沉降速度慢但是磁響應時間長,更適合移液式自動提取儀。

       

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