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      翌圣ZymeEditor平臺(tái)RPA核心酶原料助力恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)升級(jí)！
       
      重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是Piepenburg等人在2006年利用參與細(xì)胞DNA合成的蛋白重組和修復(fù)開發(fā)出的一種新的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)可以在37~42 ℃條件下實(shí)現(xiàn)待測(cè)靶標(biāo)的快速檢測(cè)。它具有反應(yīng)靈敏度高、特異性強(qiáng)、對(duì)儀器依賴程度低且可整合多種檢測(cè)模式等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基層和現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[1]。
      


      

      

       
      

      


      

      

      一、RPA技術(shù)原理
      


      

             
      

      

      

      


      

      RPA技術(shù)主要依賴于能結(jié)合寡核苷酸引物的T4噬菌體來源的重組酶T4 UvsX、單鏈結(jié)合蛋白gp32和鏈置換Bsu DNA 聚合酶以及兩條特異性的上下游引物實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，具體擴(kuò)增原理如圖1所示：
      


      


      圖1.重組酶聚合酶擴(kuò)增RPA技術(shù)擴(kuò)增原理圖[2]
      


      1.重組酶引物復(fù)合體的形成：重組酶T4 UvsX在ATP的參與和定位因子（T4 UvsY）的幫助下與擴(kuò)增引物結(jié)合形成重組酶引物復(fù)合體，并在雙鏈DNA中尋找同源序列；
      


      2.重組酶引物復(fù)合體定位至同源序列：重組酶引物復(fù)合體一旦定位到同源序列，則會(huì)插入雙鏈DNA形成D-環(huán)結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)鏈置換反應(yīng)，單鏈結(jié)合蛋白gp32會(huì)與解開的DNA鏈結(jié)合防止進(jìn)一步被置換。
      


      3.鏈置換擴(kuò)增啟動(dòng)：重組酶T4 UvsX從重組酶引物復(fù)合體中被水解，3'端引物暴露并與Bsu DNA聚合酶結(jié)合，DNA開始復(fù)制延伸，最終兩條母鏈分離，形成兩條新的互補(bǔ)雙鏈DNA。該反應(yīng)在37-42℃下進(jìn)行，可在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列1012倍的擴(kuò)增。
      


       
      

      


      

      

      

      二、RPA技術(shù)優(yōu)勢(shì)
      

      

      

      


      

      1. 檢測(cè)靈敏度高：可將痕量的核酸模板（低至單拷貝）擴(kuò)增至可以檢出的水平，且通常無需進(jìn)行核酸純化。
      


      2. 無需昂貴的配套儀器設(shè)備：37~42°C恒溫反應(yīng)，無須熱循環(huán)，擺脫儀器束縛，方便快捷。
      


      3. 樣本耐受性高：適合復(fù)雜樣本的擴(kuò)增檢測(cè)。例如未經(jīng)核酸純化的血液或鼻拭子，只需要通過熱或堿進(jìn)行預(yù)處理促進(jìn)核酸釋放即可。
      


      4. 檢測(cè)方法多樣化：包括電泳法檢測(cè)、熒光探針法檢測(cè)、側(cè)流層析試紙條檢測(cè)等。
      


       
      

      


      

      

      

      三、RPA技術(shù)應(yīng)用
      

      

      


      RPA技術(shù)可用于不同種類的目標(biāo)生物檢測(cè)，如細(xì)菌、真菌、病毒、原生動(dòng)物等的雙鏈DNA、單鏈DNA、甲基化DNA以及通過RNA或miRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA等核酸樣本。RPA技術(shù)目前已被成功應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品、疫病防控等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。
      

      


      

       
      


      


      圖2.RPA技術(shù)應(yīng)用
      


       
      


      

      

      四、RPA技術(shù)核心酶原料
      

      

      


      翌圣ZymeEditor™酶改造平臺(tái)針對(duì)RPA技術(shù)，目前已獲得RPA全系列性能優(yōu)良的產(chǎn)品，包括鏈置換Bsu DNA polymerase、T4 UvsX Recombinase、T4 UvsY protein、T4 gene 32 protein、肌酸激酶Creatine Kinase和Exonuclease III。
      

      


      

       
      


      

      

      

      

        
      

      


      

      

        
      

      


      翌圣RPA產(chǎn)品選擇指南
      

      


      

        
      

      

      

      

      


       
      


      
	
		
		
		
	
	
		
      
			產(chǎn)品名稱
			產(chǎn)品貨號(hào)
			產(chǎn)品作用
		
      
		
      
			Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)
			11078ES
			結(jié)合引物與原始靶核酸序列互補(bǔ)合成新的DNA模板
		
      
		
      
			T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)
			11079ES
			具有配對(duì)和鏈轉(zhuǎn)移活性的重組酶
		
      
		
      
			T4 UvsY protein (2 μg/μL)
			11080ES
			重組酶輔助因子，刺激T4 UvsX的單鏈DNA依賴性ATP酶活性并降低活性所需的T4 UvsX臨界濃度
		
      
		
      
			T4 gene 32 protein (gp 32) T4噬菌體基因32編碼蛋白
			11081ES
			參與DNA復(fù)制、修復(fù)、重組與解鏈后的單鏈DNA結(jié)合，防止自雜交
		
      
		
      
			Creatine Kinase (2 μg/μL) 肌酸激酶
			14502ES
			刺激ATP和肌酸分解為磷酸肌酸和ADP，釋放能量
		
      
		
      
			Exonuclease III (100 U/μL)
			14525ES
			具有3’→5’外切酶活性，切斷熒光探針中淬滅基團(tuán)，釋放熒光
		
      
	      

      

      


      

       
      

      


      

      

      

      

        
      

      


      

      

        
      

      


      客戶測(cè)試案例展示
      

      


      

        
      

      

      

      

      


      

       
      


      

      客戶采用翌圣Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)、T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)、T4 UvsY protein (2 μg/μL)、T4 gene 32 protein (gp 32)、肌酸激酶Creatine Kinase (2 μg/μL) 進(jìn)行RPA擴(kuò)增反應(yīng)，得到正確的目的條帶，且條帶清晰、明亮，結(jié)果表明，PRA技術(shù)核心酶原料可實(shí)現(xiàn)高效RPA等溫?cái)U(kuò)增。
      


      


      圖3 客戶測(cè)試翌圣重組酶聚合酶核心酶原料擴(kuò)增結(jié)果圖
      


      注：2、4為陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組；1、3為陰性對(duì)照組
      

      

      


      

       
      

      


      

      參考文獻(xiàn)
      


      [1] Zhao Y, Chen F, Li Q, Wang L, Fan C. Isothermal Amplification of Nucleic Acids. Chem Rev. 2015 Nov 25;115(22):12491-545. doi: 10.1021/acs.chemrev.5b00428. Epub 2015 Nov 9. PMID: 26551336.
      


      [2] 王亞楠, 陳昌國(guó). 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2021, 46(5):8.
      

      

      


       
      


      

       
       
       
       
       
       
       
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