精品推薦│如何生產(chǎn)一款優(yōu)秀的無甘油分子酶？
分子診斷技術因其優(yōu)異的檢測靈敏度和特異性在眾多檢測技術中脫穎而出，但常見的液體診斷試劑存在運輸成本高、保質(zhì)期短等問題，使其應用受到一定限制。隨著市場需求及技術的不斷發(fā)展、創(chuàng)新，凍干形式的分子診斷檢測試劑應運而生。相比起傳統(tǒng)液體檢測試劑來說，凍干產(chǎn)品的優(yōu)勢包括以下幾點：
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常溫穩(wěn)定——三維結構固定，可保證酶和反應體系在常溫下穩(wěn)定，無需冷鏈運輸和冰箱、冷庫保存，可延長產(chǎn)品保質(zhì)期；
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降低成本——無需冷鏈運輸和冷凍保存，可有效降低運輸和儲存成本；
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高精密度——一次反應使用一個凍干微芯，減少試劑配制時的成分誤差，縮短操作時間，防止配液過程生物活性的損失，從根本上提升精密度；
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傳統(tǒng)的分子酶或預混液往往含有高濃度的甘油作為冷凍保護劑和穩(wěn)定劑，但試劑中的甘油會破壞水的結構導致水分難以去除，從而影響凍干產(chǎn)品的結構和穩(wěn)定性，因此凍干時要優(yōu)先選擇不含甘油的試劑。此外，在那些對試劑成分敏感的應用（如數(shù)字PCR）中，使用高濃度無甘油分子酶可以進一步降低甘油對數(shù)字PCR反應的影響，同時擴大數(shù)字PCR檢測試劑體系優(yōu)化的空間。
翌圣已建立完善的無甘油分子酶研發(fā)、生產(chǎn)平臺，通過物料、環(huán)境、工藝、過程、質(zhì)量等多環(huán)節(jié)把控，目前已實現(xiàn)多種無甘油分子酶的規(guī)?；a(chǎn)。
2、篩選不同分子酶穩(wěn)定性儲液，使其能夠在4℃或者-20℃環(huán)境下長期儲存。
根據(jù)透析工藝小試過程可確定最適透析buffer成分，以及其最適儲存液，后續(xù)可采用切向流過濾工藝（也稱UFDF）進行溶液buffer的置換。
切向流過濾工藝開發(fā)關鍵在于儲存液配方、洗濾液配方、過濾環(huán)節(jié)中跨膜壓和流速的選擇。翌圣已建立標準的切向流過濾工藝的工藝流程，可根據(jù)目標分子酶甘油含量要求，快速確定洗濾體積和時間參數(shù)，節(jié)約物料成本和時間成本。
以上多個制備工藝可以應對不同體量、不同產(chǎn)品制備需求，為評估各種工藝間、同一工藝批次間的產(chǎn)品的穩(wěn)定性，翌圣也建立了對應的性能參數(shù)表征系統(tǒng)，可以從多維度評估無甘油酶的效果，表征方法包括蛋白測定、酶活測定（回收率）、甘油含量、保護劑含量測定、酶應用性能評估等。
翌圣通過ZymeEditor™酶改造平臺對qPCR/RT-qPCR、LAMP/RT-LAMP、RPA、NGS建庫等全套分子酶進行改造，同時使用無甘油分子酶制備工藝對含甘油的分子酶進行處理，目前可規(guī)?；峁┻m用于qPCR/RT-qPCR，LAMP/RT-LAMP的無甘油分子酶原料，在滿足診斷檢測便于凍干需求的同時，依然能保持與液體體系同樣的質(zhì)量和性能。
表1.翌圣無甘油分子酶產(chǎn)品清單
無甘油分子酶產(chǎn)品：37℃加速54天性能穩(wěn)定
使用Yeasen 14316ES和對應的含甘油酶分別配制成qPCR預混液，同時擴增105、104、103copies/mL的模板。結果顯示無甘油酶14316ES和對應含甘油酶擴增效果一致。將無甘油酶13705ES置于37℃進行穩(wěn)定性測試，結果顯示經(jīng)過37℃ 54天加速處理后，其擴增性能與未加速對照結果一致。以上結果表明無甘油分子酶性能與甘油酶無差異，且穩(wěn)定性好。
圖3.無甘油分子酶產(chǎn)品測試數(shù)據(jù)
RT-qPCR凍干產(chǎn)品：50℃加速25天，凍干品形態(tài)和性能穩(wěn)定
使用Yeasen 13705ES配制成RT-qPCR預混液，凍干后進行50℃加速25天穩(wěn)定性測試，同時擴增105、104、103 copies/mL的新冠假病毒模板。結果顯示：凍干品加速前后產(chǎn)品形態(tài)、Ct值和熒光值均無顯著變化，凍干產(chǎn)品穩(wěn)定性良好。
圖4.RT-qPCR凍干產(chǎn)品加速穩(wěn)定性測試數(shù)據(jù)
RT-LAMP凍干產(chǎn)品：45℃加速30天，凍干品形態(tài)和性能穩(wěn)定
使用Yeasen 14405ES搭配11297ES配制成RT-LAMP預混液，凍干后進行性能測試，陽性反應孔為橙黃色，陰性反應孔為洋紅色，反差極大，結果判讀明顯。此外，凍干后產(chǎn)品在45℃加速30天后形態(tài)無明顯變化。結果顯示：凍干品凍干后產(chǎn)品形態(tài)及性能穩(wěn)定。
圖5.RT-LAMP凍干產(chǎn)品測試數(shù)據(jù)
