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      精品推薦│熱穩(wěn)定性更強(qiáng)的Bst DNA聚合酶，讓等溫擴(kuò)增更靈敏、更便捷
       
      近年來，等溫擴(kuò)增技術(shù)因其無需專用的儀器設(shè)備、擴(kuò)增時間短、靈敏度高等特點，在現(xiàn)場檢測和即時診斷中顯示了良好的應(yīng)用前景。其中，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop mediated isothermal amplification, LAMP）使用具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶，可在恒溫條件（60-65℃）下高效、快速、特異性擴(kuò)增靶標(biāo)序列，在15-60 min內(nèi)即可實現(xiàn)109-1010倍的擴(kuò)增，目前已廣泛應(yīng)用于臨床傳染病診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全檢測等領(lǐng)域。
      


      

      

       
      

      


      

      表1. 常規(guī)PCR技術(shù)與等溫擴(kuò)增技術(shù)對比
      


      

      


      

       
      


      LAMP檢測方法分為多種，包括比濁法、pH顯色法、熒光染料法（如NHB、鈣黃綠素、SYBR Green、Syto等）、熒光探針法等，以上所有的方法都會用到關(guān)鍵核心酶原料Bst DNA聚合酶。
      

      


      

       
      


      

      

      

      01
      


      

      翌圣Bst DNA聚合酶
      

      

      

      

      


      翌圣生物Hieff® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）是將缺少5′→3′外切核酸酶結(jié)構(gòu)域的Thermophilic Geobacillus sp DNA聚合酶基因在E.coli中表達(dá)純化而得。該Bst DNA聚合酶鏈置換能力強(qiáng)，具備高靈敏度、高擴(kuò)增效率、高dUTP耐受性的優(yōu)勢，可廣泛應(yīng)用于基于等溫擴(kuò)增技術(shù)的病原體即時檢測。
      

      


      

       
      


      

      

      

      

      01
      

      


      

      靈敏度低至50 copies/T，反應(yīng)時間＜15 min（熒光定量RT-LAMP法）
      


      

       
      


      

       
      

      

      

      

      

      

      


      使用翌圣Hieff® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，擴(kuò)增新冠假病毒模板(50 copies/T)，重復(fù)20次實驗。結(jié)果顯示25 μL反應(yīng)體系中，50 copies/T的檢出率達(dá)100%，反應(yīng)時間＜15 min。
      

      


      

       
      


      


      圖1. 翌圣Hieff® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）檢測靈敏度測試結(jié)果
      

      


      

       
      


      

      

      

      

      02
      

      


      

      高dUTP耐受性
      


      

       
      


      

       
      

      

      

      

      

      

      


      使用翌圣Hieff® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，擴(kuò)增新冠假病毒模板(20 copies/T)。在推薦反應(yīng)方案中引入dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)，使用dUTP替換dTTP。對比全U（35 mM）替換（紅色擴(kuò)增曲線）與T：U = 1：1（藍(lán)色擴(kuò)增曲線）的擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)體系中添加dUTP對Hieff® Bst Plus DNA Polymerase的靈敏度及擴(kuò)增效率無影響，該酶具有較高的dUTP耐受性。
      

      


      

       
      


      


      圖2. 翌圣Hieff® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）高dUTP耐受性驗證結(jié)果
      

      


      

       
      


      

      

      

      

      03
      

      


      

      穩(wěn)定性好
      


      

       
      


      

       
      

      

      

      

      

      

      


      使用Hieff® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）搭配Hifair® III Reverse Transcriptase （Cat#11111ES）配制成RT-LAMP試劑，在37℃下放置5天測試加速穩(wěn)定性，在-20℃反復(fù)凍融測試凍融穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，RT-LAMP試劑在37℃加速5天，反復(fù)凍融10次性能穩(wěn)定。
      

      


      

      

      


      

      圖3. 翌圣Hieff® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）穩(wěn)定性驗證結(jié)果
      


       
      


      目前LAMP反應(yīng)推薦溫度為60-65℃，在該溫度下，存在靶標(biāo)核酸模板變性不徹底，樣本中存在的抑制劑難以被滅活等問題，從而可能造成模板利用率不高或模板被降解等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致LAMP檢測靈敏度受限。眾多研究表明，提高LAMP反應(yīng)溫度可以提升靈敏度[1]，減少原始臨床樣本的擴(kuò)增抑制[2-3]。LAMP反應(yīng)的溫度主要受限于Bst DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性，因此開發(fā)熱穩(wěn)定性提升的Bst DNA聚合酶對LAMP技術(shù)升級具有重要意義。
      

      


      

       
      

      


      

      

      

      02
      


      

      翌圣耐熱Bst DNA聚合酶
      

      

      

      

      


      

      

      

      

      

      

      為了獲得適用于更高溫度LAMP/RT-LAMP實驗的Bst DNA聚合酶，翌圣ZymeEditor™酶改造平臺對Bst DNA聚合酶進(jìn)行了定向改造，目前已獲得多個耐熱Bst DNA聚合酶優(yōu)勢突變體，提升了Bst DNA聚合酶在70℃高溫RT-LAMP中的擴(kuò)增性能，可為期望提升LAMP實驗靈敏度和開發(fā)免提取LAMP/RT-LAMP產(chǎn)品的客戶提供測試裝。
      


      

       
      

      


      

      

      


      

      

      


      圖4. 通過改造Bst DNA 聚合酶的熱穩(wěn)定性，相比母本，突變體M22的Tm值提高了2.9℃，能耐受70℃高溫RT-LAMP反應(yīng)
      

      

      

      

      

      


       
      

      


      

      

      

      

       
      


      

      翌圣LAMP相關(guān)產(chǎn)品選擇指南
      

      

      

      

      


      
	
		
      
			
			
      產(chǎn)品定位
      
			      		
			
			
      產(chǎn)品名稱
      
			      		
			
			
      產(chǎn)品貨號
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      高靈敏度Bst酶
      
			      		
			
			
      Hieff® Bst Plus DNA Polymerase (40 U/μL)
      
			      		
			
			
      14402ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      適合RT-Lamp的逆轉(zhuǎn)錄酶
      
			      		
			
			
      Hifair® III Reverse Transcriptase (200 U/μL)
      
			      		
			
			
      11111ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      RNase抑制劑
      
			      		
			
			
      Murine RNase inhibitor (40 U/μL)
      
			      		
			
			
      10603ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      防污染UDG酶
      
			      		
			
			
      UCF.ME® Uracil DNA Glycosylase(UDG/UNG), heat-labile, 1 U/μL
      
			      		
			
			
      14466ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      熒光染料法RT-Lamp試劑盒
      
			      		
			
			
      RT-LAMP Dye Assay Kit (UDG plus)
      
			      		
			
			
      13762ES
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      pH指示劑法RT-Lamp試劑盒
      
			      		
			
			
      RT-LAMP pH Sensitive Dyestuff Kit
      
			      		
			
			
      13906ES
      
			      		
		
      
	      

      

      


      

      注：翌圣單酶系列均可提供高低濃度、無甘油等不同產(chǎn)品形式。
      


       
      

      


      

      參考文獻(xiàn)
      


      [1] Njiru ZK, Mikosza AS, Matovu E, et al. African trypanosomiasis: sensitive and rapid detection of the sub-genus Trypanozoon by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of parasite DNA. Int J Parasitol. 2008;38(5):589-599. doi:10.1016/j.ijpara.2007.09.006.
      


      [2] Verkooyen RP, Luijendijk A, Huisman WM, et al. Detection of PCR inhibitors in cervical specimens by using the AMPLICOR Chlamydia trachomatis assay. J Clin Microbiol. 1996;34(12):3072-3074. doi:10.1128/jcm.34.12.3072-3074.1996.
      


      [3] Fereidouni SR, Starick E, Ziller M, et al. Sample preparation for avian and porcine influenza virus cDNA amplification simplified: Boiling vs. conventional RNA extraction. J Virol Methods. 2015;221:62-67. doi:10.1016/j.jviromet.2015.04.021.
      

      

      

       
       
       
       
       
       
       
      400-6111-883