Western blot所必須的內(nèi)參及標(biāo)簽抗體——衡量WB成功的標(biāo)尺
何為內(nèi)參抗體、何為標(biāo)簽抗體？
一、內(nèi)參抗體
內(nèi)參即內(nèi)部參照（Internal Control），類似于熒光定量實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因，對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來(lái)說(shuō)一般是指由看家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們?cè)诓煌M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，常用它作為檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平變化時(shí)來(lái)做參照物。
1. 內(nèi)參抗體的功能：
（1）檢測(cè)整個(gè)WB流程是否正常
（2）檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物是否正確
（3）比較表達(dá)產(chǎn)物微量的相對(duì)變化
（4）評(píng)價(jià)各個(gè)上樣孔內(nèi)蛋白的總量是否基本一致
2. 內(nèi)參抗體的選擇：
（1） 樣本種屬來(lái)源
l 哺乳動(dòng)物的組織或者細(xì)胞樣本，通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、NaK、Atpase等。
l 植物來(lái)源實(shí)驗(yàn)樣本，則可以選擇plant actin、Rubisco等。
l 根據(jù)來(lái)源樣本選擇不同的內(nèi)參，是WB實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。也可參照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。
（2）目的蛋白分子量
選擇內(nèi)參抗體時(shí)，應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5 KD以上。比如目的蛋白分子量為45 KD，此時(shí)不適宜選擇β-actin（43 KD）作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內(nèi)參。
（3）內(nèi)參蛋白的表達(dá)部位
圖1. 不同部位內(nèi)參蛋白展示圖
二、標(biāo)簽抗體
標(biāo)簽抗體的組成一般分為蛋白標(biāo)簽和目的蛋白兩部分。標(biāo)簽抗體的合成主要是將蛋白標(biāo)簽是利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和純化等。標(biāo)簽抗體（Tag Antibody）可用于檢測(cè)和純化各種商品化表達(dá)載體上的標(biāo)簽序列，分析目的蛋白的表達(dá)含量及其功能。其原理是抗原—抗體反應(yīng)，這些標(biāo)簽抗體可以高度特異地結(jié)合對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽融合蛋白。
標(biāo)簽抗體的選擇可遵循以下原則：
l 檢測(cè)蛋白A+His標(biāo)簽，選擇抗His抗體；檢測(cè)蛋白B+MBP標(biāo)簽，選擇抗MBP抗體；
標(biāo)簽抗體是開(kāi)展基因蛋白表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因功能研究的常用工具。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，相繼開(kāi)發(fā)得到具有各種不同功能的蛋白標(biāo)簽，常見(jiàn)的蛋白標(biāo)簽有His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP 等。
表1. 不同標(biāo)簽功能介紹
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融合標(biāo)簽 |
大?。↘D） |
功能 |
是否切除 |
|
HIS |
0.84 |
有利純化，能純化可溶性/包涵體蛋白 |
小標(biāo)簽，不影響蛋白功能 |
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GST |
26 |
增強(qiáng)可溶性，僅能純化可溶性蛋白 |
大標(biāo)簽，需切除 |
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MBP |
44.4 |
增強(qiáng)可溶性，減弱毒性蛋白 |
大標(biāo)簽，需切除 |
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NusA |
55 |
增強(qiáng)可溶性，減弱毒性蛋白 |
大標(biāo)簽，需切除 |
|
SUMO |
11.2 |
增強(qiáng)可溶性，減弱毒性蛋白 |
大標(biāo)簽，需切除 |
三、翌圣標(biāo)簽抗體與內(nèi)參抗體
標(biāo)簽抗體
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貨號(hào) |
名稱 |
分子量 |
應(yīng)用 |
WB稀釋比例 |
價(jià)格（元） |
|
30503ES20 |
20μl |
IF,WB,IP |
1:1000-1:5000 |
248 |
|
|
100μl |
IF,WB,IP |
1:1000-1:5000 |
748 |
||
|
1ml |
IF,WB,IP |
1:1000-1:5000 |
3287 |
||
|
5ml |
IF,WB,IP |
1:1000-1:5000 |
13687 |
||
|
30401ES50 |
50µl |
ELISA, IF, WB, IP |
1:2000-1:20000 |
688 |
|
|
30601ES60 |
100μl |
ELISA, IF, IP, WB |
1:5000 |
748 |
|
|
30701ES60 |
100μl |
WB, IP |
1:10000 |
748 |
|
|
30901ES50 |
50μl |
ELISA, WB, IP |
1:5000-50000 |
688 |
內(nèi)參抗體
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
應(yīng)用 |
WB稀釋比 |
價(jià)格（元） |
|
30101ES50 |
50 µl |
ELISA, IF, WB, IHC, FC, IP |
1:5000-50000 |
688 |
|
|
30102ES60 |
100 ul |
ELISA, IF, WB, IHC |
1:1000-10000 |
998 |
|
|
30201ES60 |
20 µl |
ELISA, IF, WB, IHC |
1:10000 |
738 |
|
|
30202ES60 |
100 ul |
WB |
1:2000 |
588 |
|
|
30301ES60 |
100 µl |
IF, WB, IHC ,IP |
1:1000 |
948 |
|
|
30302ES60 |
100 µl |
IF, IHC, IP |
1:5000-10000 |
748 |
|
|
30304ES60 |
100 µl |
WB, IF, IHC, IP |
1:5000-10000 |
948 |
其他常用內(nèi)參類型推薦
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貨號(hào) |
名稱 |
分子量 |
品牌 |
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細(xì)胞核膜 |
Lamin A/C |
65-75 KD |
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Lamin B1 |
66-72 KD |
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細(xì)胞核 |
YY1 |
65-70 KD |
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TBP |
33-43 KD |
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Histone H3 |
15-17 KD |
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PCNA |
36 KD |
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胞漿或全細(xì)胞 |
GAPDH |
36 KD |
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β-actin |
42 KD |
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Vinculin |
117 KD |
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β-Tubulin |
50-55 KD |
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α-Tubulin |
50-55 KD |
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膜蛋白 |
ATP1A1 |
97-110 KD |
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線粒體 |
COX412 |
17-20 KD |
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COX411 |
17-20 KD |
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Porin |
31-37 KD |
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全血/血漿/血清 |
Albumin |
66 KD |
四、標(biāo)簽抗體標(biāo)記的蛋白純化產(chǎn)品
1. Anti-Flag親和純化凝膠
Anti-Flag親和純化凝膠由高質(zhì)量的鼠源 IgG2b單克隆抗體與Sepharose 4B gel 通過(guò)供價(jià)偶聯(lián)制備，本產(chǎn)品具有較高的Flag標(biāo)簽融合蛋白加載容量（至少為1.1mg protein/ml gel），雜蛋白非特異結(jié)合少，可用于蛋白質(zhì)免疫沉淀（IP）和蛋白質(zhì)純化。
Anti-Flag親和純化凝膠可結(jié)合Met修飾的N端Flag融合蛋白（Met-FLAG–Protein），N端Flag 融合蛋白（FLAG–Protein），C端Flag 融合蛋白（Protein-FLAG）。
圖2. Anti-Flag親和純化凝膠IP后蛋白電泳圖
1, 國(guó)外品牌 2,Yeasen；抗體濃度：7.5mg抗體/ml凝膠；蛋白結(jié)合量：1.25mg蛋白/mL凝膠；蛋白純度：＞95%
圖3. 不同品牌Flag凝膠價(jià)格比對(duì)圖
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
價(jià)格 |
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20585ES03 |
Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag親和純化凝膠）
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1ml |
1487 |
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20585ES08 |
5ml |
4797 |
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20585ES25 |
25ml |
20987 |
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20585ES60 |
100ml |
76187 |
2. 瓊脂糖凝膠偶聯(lián)標(biāo)簽抗體
瓊脂糖凝膠偶聯(lián)標(biāo)簽抗體由高質(zhì)量的鼠源單克隆抗體與Sepharose 4B gel 通過(guò)供價(jià)偶聯(lián)制備，具有較高的標(biāo)簽融合蛋白加載容量，雜蛋白非特異結(jié)合少，可用于蛋白質(zhì)免疫共沉淀和少量蛋白質(zhì)純化。
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
價(jià)格（元） |
|
20586ES03/08 |
1ml/5ml |
1487/4797 |
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20586ES25/60 |
25ml/100ml |
20987/76187 |
|
|
20587ES03/08 |
1ml/5ml |
1487/4797 |
|
|
20587ES25/60 |
25ml/100ml |
20987/76187 |
|
|
20588ES03/08 |
1ml/5ml |
1487/4797 |
|
|
20588ES25/60 |
25ml/100ml |
20987/76187 |
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20589ES03/08 |
1ml/5ml |
1487/4797 |
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|
20589ES25/60 |
25ml/100ml |
20987/76187 |
3. 標(biāo)簽多肽
蛋白標(biāo)簽是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和純化等。Yeasen公司推出的標(biāo)簽多肽可用于與帶有相應(yīng)標(biāo)簽的蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合anti-標(biāo)簽單抗，以達(dá)到純化標(biāo)簽融合蛋白的目的。
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
價(jià)格（元） |
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20571ES11/25 |
4mg/25mg |
2157/9537 |
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20572ES11/25 |
4mg/25mg |
1237/5587 |
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20573ES08/25 |
5mg/25mg |
1237/5587 |
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20574ES08/25 |
5mg/25mg |
1237/5587 |
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20575ES08/25 |
5mg/25mg |
1237/5587 |
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20576ES08/25 |
5mg/25mg |
2557/11837 |
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20577ES08/25 |
5mg/25mg |
2557/11837 |
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20578ES08/25 |
5mg/25mg |
2557/11837 |
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20579ES08/25 |
5mg/25mg |
2157/9537 |
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20580ES08/25 |
5mg/25mg |
2157/9537 |
HB200525
