上期給大家分享了qPCR引物設(shè)計(jì)的方法。那么在后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)中如何去評(píng)判設(shè)計(jì)的引物是否符合實(shí)驗(yàn)需求呢？在國際公認(rèn)的MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)指南中關(guān)于qPCR引物有明確的規(guī)定，引物的擴(kuò)增效率是必須提供的參數(shù)（E）之一。所以本期主要向大家介紹引物擴(kuò)增效率的檢測(cè)方法。

檢測(cè)引物擴(kuò)增效率前有兩個(gè)條件：第一個(gè)是需要挑選一款性能優(yōu)良的qPCR試劑，一般可通過檢測(cè)靈敏度、精確度、線性范圍等判斷qPCR試劑的性能。第二個(gè)是需要質(zhì)量好的模板。模板質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)有純度和完整性，可通過吸光度和電泳檢測(cè)確認(rèn)。在保證qPCR試劑和模板質(zhì)量好的前提下，我們就可以進(jìn)行引物擴(kuò)增效率的檢測(cè)了。引物擴(kuò)增效率需通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行評(píng)估。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法
 

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線首先需要選擇標(biāo)準(zhǔn)品。為了保證標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品有一致的擴(kuò)增效率，標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品應(yīng)有較高的同源性。比如，待測(cè)樣品是cDNA，可選擇cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品。若待測(cè)樣品是gDNA，可選擇gDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品。下面分別介紹未知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（以cDNA為例）和已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（以質(zhì)粒DNA為例）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法。

• 未知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法：（以cDNA標(biāo)準(zhǔn)品為例）
   

一、模板

稀釋：

將反轉(zhuǎn)錄的cDNA如下圖所示進(jìn)行10倍梯度稀釋，6個(gè)梯度，依次設(shè)置為S1-S6。

 

二、qPCR反應(yīng)體系配制

以Hieff® SYBR Green為例，配制方式可參照下表，反應(yīng)體系為20μL。需注意，應(yīng)根據(jù)所使用的定量儀器型號(hào)選擇相應(yīng)濃度的校正染料ROX，具體選擇方式可參考產(chǎn)品說明書。

	S1-S6	NRT*1	NTC*2
Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix	10 μL	10 μL	10 μL
Forward Primer (10μM)	0.4 μL	0.4 μL	0.4 μL
Reverse Primer (10μM)	0.4 μL	0.4 μL	0.4 μL
梯度稀釋的模板	1 μL	-	-
RNA	-	1 μL	-
無菌超純水	to 20	to 20	to 20

【注】*1、NTC陰性對(duì)照（No Template Control），是以水為模板的對(duì)照，用于確認(rèn)是否產(chǎn)生引物二聚體和體系中是否有模板污染。

*2、NRT陰性對(duì)照（No reverse transcriptase control），是指在反轉(zhuǎn)錄過程中不加入反轉(zhuǎn)錄酶得到的樣品為模板，用于確認(rèn)是否含有g(shù)DNA污染。

 

三、樣品設(shè)置

qPCR反應(yīng)體系配制完成后，可參照下表進(jìn)行樣品設(shè)置，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)技術(shù)性重復(fù)。

 

四、qPCR反應(yīng)程序設(shè)置

以ABI 7500為例，qPCR反應(yīng)程序可參照下表進(jìn)行設(shè)置。此外，熒光標(biāo)記方式應(yīng)選擇SYBR Green，參比染料需選擇ROX。

預(yù)變性	95℃	5 min
循環(huán)反應(yīng)（40 cycles）	95℃	10 sec
	60℃	34 sec
融解曲線	95℃	15 sec
	60℃	60 sec
	95℃	15 sec

五、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：

qPCR反應(yīng)結(jié)束后，以模板系列濃度倍數(shù)log值為X軸，以對(duì)應(yīng)的Ct值為Y軸（反之亦可），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如下圖。

 

• 已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法：（以質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品為例。）
   

質(zhì)粒DNA是含有目的片段的克隆載體。一般是通過PCR擴(kuò)增目的片段，然后將目的片段插入克隆載體中，提取重組質(zhì)粒，待測(cè)序正確后即可作為標(biāo)準(zhǔn)品。質(zhì)粒DNA量可用Nanodrop等儀器測(cè)定，通過拷貝數(shù)換算公式轉(zhuǎn)換成具體的質(zhì)?？截悢?shù)，最后進(jìn)行倍比稀釋備用。

拷貝數(shù)計(jì)算公式：拷貝數(shù)=（質(zhì)量÷相對(duì)分子質(zhì)量）×6.02×1023。

具體的操作方法與實(shí)驗(yàn)設(shè)置同未知濃度標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法。

擴(kuò)增效率的計(jì)算

制作完標(biāo)準(zhǔn)曲線后，需要對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估指標(biāo)有兩個(gè)，相關(guān)系數(shù)R2和擴(kuò)增效率（E）。相關(guān)系數(shù)R2反應(yīng)了數(shù)據(jù)的線性關(guān)系，主要用來評(píng)估重復(fù)樣品的可重復(fù)性和不同濃度的初始模板是否具有相同的擴(kuò)增效率。R2值應(yīng)大于0.98，該值越接近1，表示線性關(guān)系越好，數(shù)據(jù)越準(zhǔn)確。

擴(kuò)增效率（E）計(jì)算公式：E=10^-1/斜率-1。

擴(kuò)增效率（E）：一般認(rèn)為擴(kuò)增效率應(yīng)介于90~110%之間，與之相對(duì)應(yīng)的斜率介于-3.58~-3.1之間。

常見問答

問題	可能原因	解決方案
擴(kuò)增效率偏低	1）引物設(shè)計(jì)不當(dāng)。 2）實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件不佳。	首先通過降低退火溫度，延長延伸時(shí)間，提高引物濃度或改成三步法qPCR等方式進(jìn)行優(yōu)化。若效果仍不好，重新設(shè)計(jì)引物。
擴(kuò)增效率偏高	1）非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。 2）加樣錯(cuò)誤。	1）首先通過提高退火溫度，減少延伸時(shí)間或降低引物濃度等方式進(jìn)行優(yōu)化。若效果仍不好，重新設(shè)計(jì)引物。 2）規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作。
線性關(guān)系差	標(biāo)準(zhǔn)品加樣錯(cuò)誤或降解。	檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品是否降解，規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作。
NTC有擴(kuò)增	1）引物二聚體。 2）體系或操作環(huán)境有外源DNA污染。	1）降低引物濃度或重新設(shè)計(jì)引物。 2）在超凈工作臺(tái)中操作，將反應(yīng)體系組分逐一做平行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，找出污染源。
NTC無擴(kuò)增，NRC有擴(kuò)增	RNA模板有g(shù)DNA殘留。	建議用DNase I消化RNA模板。
無擴(kuò)增曲線。	未收集熒光信號(hào)。	重新實(shí)驗(yàn)，在延伸階段收集熒光信號(hào)。

本期關(guān)于引物擴(kuò)增效率的問題我們就介紹完了，如果您還沒有檢測(cè)過引物的擴(kuò)增效率，那就趕快按照小編的檢測(cè)方法操練起來吧~

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