一文掌握HCP全套檢測(cè)方法：商品化or定制化&抗體覆蓋率
HCP概念和檢測(cè)的必要性
生物制品通常是通過(guò)重組技術(shù)經(jīng)由宿主細(xì)胞（如細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)或植物細(xì)胞）進(jìn)行生產(chǎn)的，產(chǎn)品類型包括單克隆抗體、重組蛋白和疫苗等。這些產(chǎn)品的制造和純化過(guò)程不可避免的會(huì)引入宿主細(xì)胞蛋白（Host Cell Protein，HCP）雜質(zhì)，既包括宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白也包括宿主細(xì)胞分泌的促生長(zhǎng)因子等，是具有多種生理化學(xué)和免疫學(xué)特性的復(fù)雜混合物。盡管使用先進(jìn)的純化技術(shù)，但一些宿主細(xì)胞蛋白仍將作為工藝相關(guān)雜質(zhì)殘留在中間藥物產(chǎn)品中。
這些雜質(zhì)有潛在的免疫原性，也可能作為佐劑增強(qiáng)生物藥物的產(chǎn)品的免疫反應(yīng)，還會(huì)影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性和功效，從而引發(fā)人體安全性風(fēng)險(xiǎn)，因此，對(duì)于HCP的去除水平需要建立合適的監(jiān)測(cè)策略，并控制終產(chǎn)品中HCP的含量以符合藥物質(zhì)量的要求。
HCP法規(guī)監(jiān)管要求
生物制品中HCP殘留含量通常被認(rèn)為是產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)，是工藝穩(wěn)健性監(jiān)測(cè)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，也是產(chǎn)品的重要質(zhì)控指標(biāo)。各國(guó)法規(guī)都有涉及HCP的論述，要求必須對(duì)生物藥品進(jìn)行分析和純化，以將宿主細(xì)胞蛋白HCP降低到可接受的水平。對(duì)HCP的接受程度將根據(jù)具體情況進(jìn)行評(píng)估，并取決于多個(gè)因素，其中包括：劑量、給藥頻率、藥物類型和疾病嚴(yán)重程度。
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《中國(guó)藥典》三部（2020版）規(guī)定：針對(duì)CHO細(xì)胞，HCP殘留需要<0.05%（相當(dāng)于小于500ppm）；針對(duì)E.coli，HCP殘留需要<0.01%。
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美國(guó)藥典USP<1132>章節(jié)規(guī)定：用一種靈敏度較高的方法檢測(cè)藥品中的HCP，其含量應(yīng)該低于檢測(cè)限（通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCP含量應(yīng)小于100ng，也即<0.01%）。
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歐洲藥典EP 2.6.34中規(guī)定：在生物制品中，HCP的含量應(yīng)當(dāng)小于0.1%。
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國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）指南：ICH Q6B指出，需要根據(jù)ICH準(zhǔn)則采用敏感且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的有效方法來(lái)監(jiān)控殘留的HCP，其殘留量通常要求小于100ppm。
由此可見(jiàn)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)于HCP的要求是高度一致的，生物制品的工藝開(kāi)發(fā)必須經(jīng)過(guò)HCP檢測(cè)，并證明純化工藝能夠?qū)CP降低到安全水平，并且在最終產(chǎn)品的殘留量限值中，中美的推薦限度值均在0.01%以下。
HCP檢測(cè)方法
酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是目前HCP檢測(cè)最常用的方法，在2020版《中國(guó)藥典》通則3412/3413/3414中提到的宿主蛋白殘留檢測(cè)方法均為ELISA法。
美國(guó)藥典USP<1132>章節(jié)中也提到可采用電泳法、ELISA和LC-MS/MS等方法檢測(cè)HCP含量，且由于ELISA法操作簡(jiǎn)便、快速、高靈敏、高通量等特點(diǎn)，而被推薦為HCP檢測(cè)的首選方法。
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)
用途：
檢測(cè)HCP中蛋白的總量，可用于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和過(guò)程控制，目前是檢測(cè)HCPs的常用方法。
優(yōu)勢(shì)：
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高靈敏度和特異性；
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高通量及可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；
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定量性；
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操作簡(jiǎn)便、快速。
劣勢(shì)：
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需要特異性抗體；
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無(wú)法特異鑒別和評(píng)估單個(gè)HCP；
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方法開(kāi)發(fā)較為復(fù)雜，抗原需要特殊制備；
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方法的影響因素較多，HCPs覆蓋率需評(píng)估；
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無(wú)法鑒定出種類。
免疫印跡(Western Blotting)
用途：
用于大量樣品的一致性篩選，以及檢測(cè)與抗HCPs抗體反應(yīng)的未知蛋白。適用于檢測(cè)HCPs,并提供HCPs相對(duì)分子質(zhì)量的大概信息。
優(yōu)勢(shì)：
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特異性；
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結(jié)果直觀可視化：通過(guò)蛋白質(zhì)大小和表達(dá)水平的差異進(jìn)行可視化；
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可檢定和定量特定的HCP。
劣勢(shì)：
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半定量性；
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僅限于特定蛋白：只能檢測(cè)到與抗體結(jié)合的HCP；
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對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物不夠敏感；
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蛋白質(zhì)SDS變性可能導(dǎo)致構(gòu)象表位的丟失；
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靈敏度需依賴多克隆抗體質(zhì)量。
二維凝膠電泳法(2-DE)
用途：
常用于上游或下游工藝開(kāi)發(fā)和表征，其可在單一凝膠上分辨不同HCPs。
優(yōu)勢(shì)：
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不需要免疫印跡，避免了轉(zhuǎn)膜的問(wèn)題；
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可以實(shí)現(xiàn)痕量HCPs雜質(zhì)與產(chǎn)品的分離；
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提供大概相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)信息。
劣勢(shì)：
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過(guò)量的蛋白可能會(huì)掩蓋HCPs斑點(diǎn)；
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可觀察到樣品中HCP的分布，但無(wú)法量化。
質(zhì)譜分析(Mass Spectrometry)
用途：
鑒定單個(gè)HCP，提供準(zhǔn)確的宿主細(xì)胞蛋白鑒定和定量信息
優(yōu)勢(shì)：
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高分辨率和準(zhǔn)確性；
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鑒定及監(jiān)控各個(gè)HCP；
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提供HCP的全面譜圖；
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能夠覆蓋廣泛的蛋白質(zhì)；
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可鑒定出HCP種類。
劣勢(shì)：
設(shè)備和技術(shù)要求高；
操作較為復(fù)雜；
成本較高；
方法通量低；
較為復(fù)雜的樣品前處理；
潛在的基質(zhì)影響；
需要專業(yè)的數(shù)據(jù)分析能力。
ELISA是各國(guó)藥典推薦的在生物制品中檢測(cè)殘留HCP的方法，可以測(cè)定HCP的總量，但其存在局限性，無(wú)法鑒別HCP的種類及豐度，需要其他方法與之互相補(bǔ)充。每種檢測(cè)方法都各有其優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹悠诽匦?、?zhǔn)確性和操作便捷性等方面進(jìn)行選擇，結(jié)合使用不同的方法來(lái)獲得更全面和準(zhǔn)確的結(jié)果。
此外，美國(guó)藥典USP<1132>和歐洲藥典EP2.6.34. HOST-CELL PROTEIN ASSAYS指出在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的不同階段，推薦采用不同的ELISA試劑盒用于HCP的檢測(cè)，并將HCP檢測(cè)方法分為：商業(yè)化試劑盒、產(chǎn)品/工藝專屬性方法和平臺(tái)化方法。
USP<1132>提到在沒(méi)有平臺(tái)化方法的情況下可以在臨床前、臨床I期、II期使用商品化試劑盒；在臨床III期/工藝驗(yàn)證及產(chǎn)品上市后，由于商業(yè)化的通用HCP檢測(cè)試劑盒抗體的覆蓋率往往不足等局限性，需要考慮結(jié)合細(xì)胞類型及工藝特異性等因素，使用平臺(tái)化方法或針對(duì)上游工藝開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品/工藝專屬性方法。
圖1.USP <1132>中產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的不同階段HCP檢測(cè)方法的建議
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方法 |
通用商品化試劑盒 |
項(xiàng)目專屬性檢測(cè)方法 |
平臺(tái)化檢測(cè)方法 |
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可用性 |
即時(shí)可用 |
需要制備抗原，包括克隆空載體細(xì)胞系 |
需要使用裸細(xì)胞系或空載體細(xì)胞系制備抗原 |
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開(kāi)發(fā) |
無(wú)需太多準(zhǔn)備工作 |
包括抗原表征、免疫和確認(rèn)在內(nèi)的檢測(cè)開(kāi)發(fā)至少需要6個(gè)月時(shí)間 |
包括抗原表征、免疫和確認(rèn)在內(nèi)的檢測(cè)開(kāi)發(fā)至少需9個(gè)月時(shí)間 |
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多樣性 |
僅限于最常見(jiàn)的表達(dá)系統(tǒng) |
各類型表達(dá)系統(tǒng)均可用 |
各類型表達(dá)系統(tǒng)均可用 |
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特異性 |
特異性可能不佳，很可能有未檢測(cè)到的HCP |
特異性通常有所增強(qiáng)，抗體覆蓋率更能針對(duì)特定的HCP模式 |
與商業(yè)檢測(cè)方法相比，特異性有所提高，對(duì)檢測(cè)性能的理解有所增強(qiáng)，對(duì)HCP種類的覆蓋率也有所提高 |
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費(fèi)用 |
初期價(jià)格相對(duì)便宜，但對(duì)整個(gè)下游純化過(guò)程而言，開(kāi)發(fā)成本將迅速上升 |
初期成本較高，但收支平衡點(diǎn)通常是在100套試劑盒的價(jià)值 |
由于可用于多種產(chǎn)品，具有顯著的成本優(yōu)勢(shì) |
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依賴性 |
依賴于某個(gè)供應(yīng)商，試劑和控制方案屬于“黑箱”狀態(tài)。 |
能對(duì)所有試劑和緩沖液取得全面控制，可以隨時(shí)進(jìn)行調(diào)整 |
對(duì)所有試劑具有完整的所有權(quán)和控制權(quán)，可降低供應(yīng)鏈和批次可比性的風(fēng)險(xiǎn) |
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監(jiān)管需求 |
不適合用于支持上市許可申請(qǐng) |
適用于支持許可產(chǎn)品從早期開(kāi)發(fā)到最終產(chǎn)品上市的整個(gè)過(guò)程 |
適用于支持早期開(kāi)發(fā)直至上市許可的整個(gè)過(guò)程 |
表2.不同HCP試劑盒類型的比較
翌圣生物通用商品化HCP試劑盒
ELISA法是一種使用簡(jiǎn)單、靈敏度高且客觀的HCP檢測(cè)方法。翌圣生物科技（上海）股份有限公司自主研發(fā)了多款能夠檢測(cè)使用了宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染以及蛋白表達(dá)的各生物制品下游純化過(guò)程樣品以及終產(chǎn)品中宿主蛋白殘留量的試劑盒。試劑盒均采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)（ELISA）的實(shí)驗(yàn)原理，以及生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)，能夠高靈敏的檢測(cè)樣本中HCP殘留量。試劑盒可以用于生物制品純化工藝過(guò)程的優(yōu)化、中間工藝過(guò)程的雜質(zhì)控制以及終產(chǎn)品的放行檢測(cè)。
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宿主細(xì)胞殘留蛋白檢測(cè) |
貨號(hào)與網(wǎng)址 |
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E.coli HCP ELISA檢測(cè)試劑盒 |
36712ES http://www.vaaedu.com/products/detail/5004 |
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E.coli HCP ELISA 檢測(cè)試劑盒（質(zhì)粒） |
36721ES http://www.vaaedu.com/products/detail/5984 |
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HEK293 HCP ELISA檢測(cè)試劑盒 |
36713ES http://www.vaaedu.com/products/detail/5444 |
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CHO HCP ELISA檢測(cè)試劑盒 |
36714ES http://www.vaaedu.com/products/detail/5842 |
翌圣生物定制化HCP試劑盒開(kāi)發(fā)服務(wù)
鑒于HCP檢測(cè)的重要性，翌圣生物以高性能單克隆抗體研發(fā)平臺(tái)為依托，建立了蛋白抗體關(guān)鍵原料研發(fā)平臺(tái)和獨(dú)立的免疫檢測(cè)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室，并配備了先進(jìn)研發(fā)儀器設(shè)備，如：酶標(biāo)儀和2D-WB雙向凝膠電泳-免疫印跡儀等。研發(fā)平臺(tái)已經(jīng)非常成熟，可以快速完成哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞（如Sf9）、細(xì)菌和酵母等多種宿主細(xì)胞殘留蛋白（HCP）試劑盒定制服務(wù)。
宿主細(xì)胞殘留蛋白檢測(cè)試劑盒定制服務(wù)，周期6~10個(gè)月。
抗原抗體制備：確定HCP抗原、建立HCP參考品、制定免疫路徑和策略、制備HCP抗體等，周期通常4~6個(gè)月；
試劑盒開(kāi)發(fā)：抗體優(yōu)化、覆蓋率分析、試劑盒方法驗(yàn)證等，周期通常2~4個(gè)月。
翌圣生物HCP抗體覆蓋率驗(yàn)證服務(wù)
已知，ELISA法是行業(yè)內(nèi)檢測(cè)HCP殘留的金標(biāo)準(zhǔn)，然而該方法的準(zhǔn)確性取決于多克隆抗體對(duì)HCP的覆蓋率。《美國(guó)藥典》和《歐洲藥典》中提到免疫親和純化、2D-WB是表征HCP ELISA抗體及其覆蓋率的推薦方法。
2D-WB首先采用二維凝膠根據(jù)大小和電荷分離蛋白質(zhì)，然后將這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上與 HCP 抗體一起孵育以進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。
翌圣生物擁有全套2D-WB儀器設(shè)備和豐富的實(shí)驗(yàn)室操作經(jīng)驗(yàn)，可針對(duì)CHO、E.coli、HEK293等宿主細(xì)胞的HCP樣品，提供抗體覆蓋率驗(yàn)證服務(wù)。
參考文獻(xiàn)：
[1]USP <1132> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals.
[2]USP <1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry.
[3]EP-2.6.34. Host-Cell Protein Assays.
[4]2020版《中國(guó)藥典》3412大腸埃希菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法、3413假單胞菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法、3414酵母工程菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法。
