多重PCR(multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR)也稱復合PCR，由Chambehian'于1988年首次提出。其基本原理與常規(guī)PCR相同，區(qū)別在于多重PCR反應體系加入一對以上引物，各對引物分別結(jié)合在模板相對應部位，最終擴增出一條以上目的DNA片段（圖1）。

圖1. 多重PCR原理

多重PCR可以通過優(yōu)化反應體系和反應條件提高擴增的片段數(shù)量。理論上只要PCR擴增的條件合適，引物對的數(shù)量可以不限。另外，多重PCR在引物和反應條件的設計方面表現(xiàn)出很大的靈活性，既有單個PCR的特異性和敏感性，又較之快捷和經(jīng)濟，自提出以來已被廣泛應用于包括核酸診斷在內(nèi)的諸多領域（圖2）。

圖2 . 多重PCR的應用

需要指出的是多重PCR實驗并不是簡單地將多對特異性引物混合成一個反應體系。多重PCR之所以難，在于多個靶點之間擴增條件不兼容，每個靶點都需要旁邊其他的引物配合。舉個例子，就像“綁腿賽跑”（圖3）。

圖3. 綁腿賽跑

每個靶點的成功擴增都需要被捆綁在一起的兩個人（一對引物）配合默契。而多重PCR就需要多對選手同時起跑又同時到達，并且所有參賽的每對選手都有最好的，而且均衡的發(fā)揮。

因此，多重PCR實際操作過程中的擴增效果和實際擴增的片段數(shù)目往往不盡如人意。而為了達到更好的擴增效果，一般我們可以通過以下幾個方面進行優(yōu)化：

2.1 引物

多重PCR實驗中要求加入的多對引物既不能互相結(jié)合，也不能與模板DNA上目標片段以外的區(qū)域結(jié)合。另外傳統(tǒng)的多重PCR實驗中，為了使結(jié)果便于凝膠檢測，還需設計不同擴增子片段大小不一。更麻煩的是，多重PCR中的不同擴增片段還會互相競爭資源，其結(jié)果是高豐度模板能夠被很容易的檢測到，而低豐度的模板徹底淪為背景。因而引物設計除了遵循一般的規(guī)則之外，還需要注意以下幾點：

a. 引物特異性：

各引物與其它擴增片段不能存在較大的互補性，擴增片段之間也不能有較大同源性；

b. 引物長度：

一般18-24堿基，各引物之間不能互補，尤其避免3’端互補。較長的引物更易形成二聚體；

c. 退火溫度：

退火溫度選擇標準：提高每一對引物的退火溫度，然后在mPCR的時候采取最低退火溫度；

d. 引物結(jié)構(gòu)設計：

通過一些獨特的結(jié)構(gòu)設計，避免非特異性擴增或者引物二聚體。比如Ω引物（如圖3），該引物包括三部分，5’端的序列，Ω環(huán)，3’端序列。其中兩端的序列是和目標區(qū)域互補的，而環(huán)不是。對于Ω引物，當5端和3端序列完全配對才可以進行目標區(qū)段擴增，否則其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定（因為Ω環(huán)存在），導致擴增失敗。

常用引物設計網(wǎng)址:

http://www.premierbiosoft.com/primerplex/index.html

http://people.ds.cam.ac.uk/ssb22/pooler/(only for cancer researchers)

2.2 反應體系

多重PCR的反應體系也是影響擴增效果的重要因素之一，體系中的各組分需滿足每對引物對應的靶點的擴增量的要求。反應體系包括引物、模板、緩沖液、DNA聚合酶、dNTP和Mg2+等，其作用與優(yōu)化方法如下表1所示。

表1. 反應體系的優(yōu)化

注：本文中DNA聚合酶以Taq DNA聚合酶為例。具體實驗中，還可以在反應體系中適當增加濃度為5%的DMSO或者5% 的甘油等輔助劑，有利于提高擴增效率以及特異性。

2.3 反應條件

多重PCR反應中會存在以下兩種問題：1）目的產(chǎn)物長度不盡相同，而較小片段總是優(yōu)先得到擴增；2）各對引物的最佳PCR條件也不盡相同，比如較長片段需要更長的延伸時間。因此為了保證最終擴增產(chǎn)物的量盡可能的一致，在優(yōu)化反應條件的時候，盡可能選擇有利于較大片段擴增的條件，見表2。

表2. 反應條件的優(yōu)化

3. 常見問題解決辦法

多重PCR擴增的時候主要的問題：二聚體、非特異性擴增以及擴增產(chǎn)物條帶較弱。

表3. 常見問題解決辦法

多重PCR要求在同一反應體系內(nèi)對多個位點進行特異性擴增。因而引物間的配對與競爭性擴增均會影響擴增效果。如果能選擇合適的反應體系以及反應條件則有望提高多重PCR的擴增效果。所以在進行多重PCR的時候，不應墨守陳規(guī)，要根據(jù)自身實驗情況對實驗條件進行不斷優(yōu)化，達到最佳擴增效果。