扒一扒！無血清培養(yǎng)添加物-常見細胞因子
無血清培養(yǎng)
細胞體外培養(yǎng)時需要在培養(yǎng)基中加入血清，以維持細胞的生長和存活。而血清，尤其是牛血清，成分復雜、批間差大和存在病原體污染的可能性，不確定的動物源性對細胞培養(yǎng)會帶來顯著的外源物質污染風險，因此科研人員對無血清培養(yǎng)基的需求日益增加，目前無血清培養(yǎng)基廣泛應用于疫苗生產、單抗、活性蛋白等生物制品和細胞治療等的領域中。無血清培養(yǎng)基中不含血清，為能夠實現(xiàn)與含血清培養(yǎng)基相似的維持和促進細胞生長的功能，其中必須添加白蛋白(Albumin)、胰島素(Insulin) 和轉鐵蛋白(Transferrin)等營養(yǎng)成分來替代血清。
生長因子在無血清培養(yǎng)中的作用
促細胞貼壁
許多細胞必須添加促貼壁物質才能貼壁生長，促貼壁物質一般為細胞外基質，如纖連蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白和膠原蛋白等。
增加細胞存活率
無血清培養(yǎng)基中不含有血清成分，細胞在無血清培養(yǎng)基中生長需要的營養(yǎng)成分更為單一，因此細胞的存活率可能會受到影響。添加適當的生長因子可以改善無血清培養(yǎng)基中的營養(yǎng)條件，進而提高細胞的存活率。無血清培養(yǎng)必需補充的細胞生長的營養(yǎng)物質，如胰島素、轉鐵蛋白和血清白蛋白等。
促進細胞增殖和功能維持
生長因子可以促進細胞增殖，從而提高細胞的生長速度。在無血清培養(yǎng)基中，添加一些能夠促進細胞增殖的生長因子，如表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等，能夠有效地促進細胞的增殖。
促進細胞分化
生長因子可以促進細胞分化，從而促進細胞的功能發(fā)揮。在無血清培養(yǎng)基中，添加一些能夠促進細胞分化的生長因子，如轉化生長因子β（TGF-β）、神經營養(yǎng)因子（NGF）等，能夠有效地促進細胞的分化。
提高細胞表型的穩(wěn)定性
無血清培養(yǎng)基中不含有血清成分，對于某些細胞來說，可能會導致細胞的表型不穩(wěn)定。添加適當的生長因子可以提高細胞表型的穩(wěn)定性，從而提高細胞的應用效果。
無血清培養(yǎng)基中常添加的生長因子
堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)
bFGF是一種肝素結合促有絲分裂蛋白，可在無血清或減血清條件下促進多種細胞的增殖。bFGF是干細胞培養(yǎng)中的一種關鍵生長因子，它不僅是重要的促有絲分裂因子，還是形態(tài)發(fā)生和分化的誘導因子。在胚胎干細胞培養(yǎng)中，bFGF有助于干細胞在無血清培養(yǎng)基中保持未分化狀態(tài)。
胰島素（Insulin）
胰島素可維持無血清細胞培養(yǎng)液中細胞的生長，調節(jié)細胞對葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的攝取、利用和貯存，同時抑制糖原、蛋白質和脂肪的分解。胰島素也具有對抗細胞凋亡的作用。胰島素通常以每升1-10mg的濃度添加到細胞培養(yǎng)基中。
表1. 胰島素對細胞作用的分類及特點
胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)
在無血清培養(yǎng)基的配制中，常用IGF-I 來替代胰島素，IGF-I 在很低的濃度即可實現(xiàn)促細胞生長作用，而胰島素需要遠遠高于生理濃度。IGF-1通過與IGF-1受體結合，促進蛋白質合成代謝，影響糖原代謝、DNA合成和葡萄糖攝取，具有抗凋亡作用。在無血清培養(yǎng)基中，IGF-1有助于細胞維持較高的活率和持續(xù)增殖的能力。
長效IGF-I（LR3 IGF-I）
Long R3 IGF-I (LR3 IGF-I) 也可稱為長效IGF-I，與胰島素相比，LR3 IGF-I添加到無血清培養(yǎng)基中后不容易被降解，作用更持久，因此也叫長效IGF-1。
LR3 IGF-I 是以IGF-I 為基礎改造而來。改造后，LR3 IGF-I 仍具有高親合力結合IGF-IR 的能力，因此保持著與IGF-I 相似的促細胞增殖活性。同時，改造后，LR3 IGF-I與IGF 結合蛋白( IGFBPs)的親合力明顯下降。所有哺乳動物細胞均會分泌IGFBPs，而IGFBP可結合并抑制IGF-I 的活性，而改造后的LR3 IGF-I 與IGFBPs 的親合力比其原型分子IGF-I 下降1000 多倍，因此其活性可極大程度地避免被IGFBPs 所抑制，從而使LR3 IGF-I 的活性較IGF-I 大為提高。
LR3 IGF-1相比胰島素，促細胞增殖能力更強，培養(yǎng)的細胞密度更高，細胞活力更好，且LR3 IGF-1比胰島素在培養(yǎng)液中半衰期更長，生物活性更長效。
表2. 人 LR3 IGF-1、IGF-1和胰島素的區(qū)別
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參數 |
Insulin |
IGF-1 |
LR3 IGF-1 |
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中文名 |
胰島素 |
胰島素樣生長因子-1 |
長型胰島素樣生長因子-1 |
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蛋白來源 |
重組表達 |
重組表達 |
重組表達 |
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分子結構 |
異源二聚體 |
單體 |
單體 |
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分子量 |
5.8 kDa(51個氨基酸） |
7.6 kDa(70個氨基酸） |
9.1 kDa(83個氨基酸） |
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受體 |
胰島素受體（IR） |
IGF-1受體（IGF-IR） |
IGF-1受體（IGF-IR） |
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與IGF-1受體結合的親和力 生物學效應 |
低親和力 促進細胞生長 |
高親和力 促進細胞生長 |
高親和力 促進細胞生長 |
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與胰島素受體結合的親和力 生物學效應 |
高親和力 調節(jié)細胞代謝 |
低親和力 調節(jié)細胞代謝 |
低親和力 調節(jié)細胞代謝 |
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與IGF結合蛋白（IGFBP）的結合 |
不結合 |
高親和力 |
低親和力 |
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在細胞培養(yǎng)過程中的穩(wěn)定性 |
比較不穩(wěn)定 |
穩(wěn)定 |
很穩(wěn)定 |
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無血清培養(yǎng)基中的添加劑量 是否高于生理濃度 |
1-10mg/L 遠高于（約100倍） |
10-100μg/L 不高于 |
10-100μg/L 不高于 |
表皮生長因子 (EGF)
一種重要的促有絲分裂生長因子，通過與細胞表面受體結合，促進培養(yǎng)細胞的長期增殖。在無血清細胞或減血清條件下培養(yǎng)基中，誘導多種細胞的分化。
肝細胞生長因子 (HGF)
HGF是成熟實質肝細胞的一種強效、間質衍生的有絲分裂原，廣泛組織和細胞類型的生長因子。HGF通過MET的跨膜酪氨酸激酶受體發(fā)出信號。HGF的活性包括誘導細胞增殖、運動、形態(tài)發(fā)生、抑制細胞生長和增強神經元存活。HGF是肝臟再生過程中至關重要的有絲分裂原。HGF能夠刺激原代無血清培養(yǎng)的肝細胞DNA的合成，對多種組織器官的生長發(fā)育具有重要的生理調節(jié)功能。
轉鐵蛋白 (Transferrin)
無血清培養(yǎng)基為達到與含血清培養(yǎng)基相同或相似的細胞培養(yǎng)性能，其中也必須添加轉鐵蛋白，以實現(xiàn)對細胞鐵離子平衡的調節(jié)，以及對細胞生長和增殖的維持。
分類：轉鐵蛋白以三種形態(tài)存在：脫鐵（Apo）（不結合鐵離子）、飽和鐵(Holo）（結合兩分子鐵離子）和部分飽和。
如何選擇：無血清培養(yǎng)基中多數都添加Holo-transferrin，因為Holo-transferrin 除發(fā)揮轉鐵作用外，自身即可作為細胞的鐵源，無需在培養(yǎng)基中另加外源性鐵。但在某些本身含鐵量高的培養(yǎng)基(如DMEM/F12)中，則可使用Apo-transferrin 這種不含鐵的轉鐵蛋白。
使用濃度：細胞種類不同，對轉鐵蛋白的需求量也不同，下表僅供參考。具體的濃度還是要根據細胞的種類、狀態(tài)和想要實現(xiàn)的功能來通過實驗確定。
表3.轉鐵蛋白在無血清培養(yǎng)基中的使用濃度
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細胞類型 |
原代細胞 |
CHO(中國倉鼠卵巢細胞） |
雜交瘤和Vero細胞 |
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轉鐵蛋白工作濃度 |
5-100mg/L |
10-50mg/mL |
5-20mg/mL |
轉鐵蛋白在無血清培養(yǎng)基中的作用：
避免細胞外環(huán)境中自由基的產生，防止細胞受到傷害
轉鐵蛋白可以與鐵離子高親合力結合，當被添加入無血清培養(yǎng)基后，在細胞外的培養(yǎng)環(huán)境中基本不會存在游離的鐵離子，也就不會發(fā)生自由基反應，故可避免自由基對細胞的損傷。
維持細胞的生長和增殖
細胞內有很多重要的蛋白，如血紅素、核糖核苷酸還原酶、DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA引物酶等，需要結合鐵離子后才能發(fā)揮其活性，這些蛋白基本上都與DNA 的復制、修復以及DNA 的穩(wěn)定性有關，也就是說它們影響著細胞的生長和增殖。轉鐵蛋白通過與其在細胞表面的受體結合，將鐵離子轉運并釋放到細胞內后，這些鐵離子會與需鐵蛋白結合，然后發(fā)揮后者維持細胞生長和增殖的功能。如果無血清培養(yǎng)基中不含轉鐵蛋白，細胞內的需鐵蛋白將無法獲得鐵離子，會失去活性，導致細胞生長停滯或死亡。
維持細胞內的鐵平衡
在細胞培養(yǎng)中，并不是鐵越多越好，而應當是在適當的時間獲得適量的鐵。如果細胞內的鐵過多，也跟細胞外環(huán)境一樣，鐵會誘導產生破壞力極強的羥基自由基。而如果細胞內鐵過少，則不足以維持細胞的生長和增殖。轉鐵蛋白調節(jié)細胞內的鐵平衡，與細胞表面的轉鐵蛋白受體有關。細胞表面轉鐵蛋白受體的數目不是固定不變的，而是隨著細胞對鐵的需求程度而上調或下調，因而可自主影響細胞對鐵的攝取量一般而言，靜止未活化的細胞表面轉鐵蛋白受體相對較少，而活化增殖的細胞表面轉鐵蛋白受體數目顯著增加。此外，在細胞培養(yǎng)中，轉鐵蛋白受體數目與培養(yǎng)環(huán)境中鐵的含量也密切相關。培養(yǎng)環(huán)境中的含鐵介質比較多，則細胞表面轉鐵蛋白受體的數目會減少，從而避免細胞攝入過量的鐵。
白蛋白（HSA）
白蛋白是許多無血清細胞培養(yǎng)的重要組成部分，例如雜交瘤或中國倉鼠卵巢（CHO）細胞的系統(tǒng)。白蛋白具有多種生理功能，包括：金屬離子結合劑、自由基清除劑、滲透壓和pH值的調節(jié)劑、生長因子的運載體、表面活性劑以及營養(yǎng)劑等。
纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）
纖維連接蛋白添加到培養(yǎng)基中，替換或降低血清使用量，促進細胞貼壁、遷移、移動生長、維持細胞狀態(tài)。具體作用如下：
纖維連接蛋白可以與細胞表面整合素等受體結合,促進細胞與培養(yǎng)皿的粘附,這是細胞成功培養(yǎng)的前提。特別是一些黏附力較弱的細胞,添加纖維連接蛋白可以顯著提高其培養(yǎng)成功率。
纖維連接蛋白除了增強細胞附著外,還可以通過與細胞表面受體的相互作用,激活下游信號轉導通路,促進細胞周期進程,實現(xiàn)細胞的增殖。
維持細胞形態(tài)。纖維連接蛋白與細胞結合后,可以影響細胞骨架的排列和細胞形態(tài)的維持。此作用對于某些依賴于reshape的細胞功能和分化很重要。
促進細胞遷移。纖維連接蛋白在體內發(fā)揮著引導細胞遷移的作用。在體外培養(yǎng)中可以形成化學梯度以誘導細胞的定向遷移,這對研究細胞轉移機制很重要。
誘導細胞分化。不同濃度和構象的纖維連接蛋白，可以與不同類型的細胞相互作用，展示不同的生物學效應，誘導細胞向特定的方向分化。這在定向誘導多潛能細胞分化中很重要。
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