高通量測序中的文庫構(gòu)建指的是在DNA兩端連接特定的接頭從而使其符合測序平臺要求的過程，在高通量測序過程中，文庫質(zhì)量直接影響最終測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，打個比方，如果文庫上機測序的濃度很低，樣本在FlowCell上擴增所形成的DNA樣本簇就會很少，測序數(shù)據(jù)量也將減少，這就可能導(dǎo)致測序失敗，所以我們說文庫的質(zhì)量控制和質(zhì)量評估也是NGS中的關(guān)鍵步驟。
 

文庫如何質(zhì)控？
評估文庫質(zhì)量的方法有哪些？

▇ 文庫質(zhì)控：文庫在上機之前都有會進行質(zhì)量檢測，質(zhì)量檢測合格的文庫才會上機測序。文庫上機之前的文庫質(zhì)控主要包括文庫片段大小和文庫濃度的質(zhì)控，具體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和實驗設(shè)計見往期推送：文庫質(zhì)檢方案的合理設(shè)計--文庫分布、文庫濃度、文庫質(zhì)量。

▇ 文庫評估：文庫評估方法除了文庫大小和濃度之外，還包括文庫轉(zhuǎn)化率、文庫復(fù)雜度、均一性、準(zhǔn)確性和覆蓋度等。

      1）文庫轉(zhuǎn)化率：是評估文庫質(zhì)量的重要指標(biāo)，它指的是文庫中兩端都連上接頭的目的片段占總片段數(shù)的比值，也代表測得產(chǎn)量與理論最高產(chǎn)量之間的比值，這里的理論最高產(chǎn)量考慮了PCR的擴增效率問題及純化產(chǎn)生的損失。計算方法如下：
 

理論最高產(chǎn)量=輸入量×（1+PCR擴增效率）（PCR循環(huán)數(shù)）×（純化回收率）（clean up數(shù)）
 

為什么說文庫轉(zhuǎn)化率是重要指標(biāo)呢？這是因為只有雙端都連接上接頭的目的片段才能在FlowCell上面通過橋式擴增形成簇，最終完成測序過程，而不是雙端都連上接頭的目的片段最終都不能完成測序過程，視為無效片段，如果這樣的片段過多直接影響最終輸出數(shù)據(jù)的過少，甚至可能直接導(dǎo)致測序的失敗。
 

圖1.雙端帶接頭的DNA片段在Flowcell上擴增圖
 

2）文庫復(fù)雜度：指的是文庫中DNA序列的復(fù)雜程度，一定的文庫復(fù)雜度對后期測序數(shù)據(jù)的分析尤為重要，復(fù)雜度高的文庫測序得到的數(shù)據(jù)重復(fù)讀數(shù)少，可以帶來更多有意義的信息，反之，低復(fù)雜度的文庫在信號讀取時往往產(chǎn)生簇信號混雜，易產(chǎn)生低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。

文庫復(fù)雜度與Input樣本質(zhì)量、文庫的轉(zhuǎn)化率、文庫擴增時循環(huán)數(shù)有關(guān)。當(dāng)文庫的轉(zhuǎn)化率越高時，能從樣品種捕獲更多的特異分子，文庫復(fù)雜度就越高；當(dāng)輸入樣本量越低或文庫擴增循環(huán)數(shù)越多時，文庫中不能帶來有意義信息的重復(fù)讀數(shù)就會增多，則文庫的復(fù)雜度越低。

 

表1.測序數(shù)據(jù)關(guān)鍵參數(shù)比較

Sample Input	Library Prep	Uniquely Mapped	Duplication Rate	Transcripts   Detected	Genes Detected
4 μg	A*	69%	31%	111.370	20.547
	B*	76%	24%	112.136	21.016
500 μg	A*	64%	36%	109.810	20.134
	B*	71%	29%	110.690	20.644

       3）均一性：指的是讀取數(shù)據(jù)在基因組或目標(biāo)區(qū)域的分布均一程度。其生信分析圖如圖2所示，一般認(rèn)為覆蓋越均勻，達(dá)到特定深度所需的測序數(shù)據(jù)就越少，覆蓋均一性的偏向通常是在文庫制備和文庫擴增步驟中引入的，也就是說，覆蓋均一性很多時候取決于GC含量。

圖2.測序數(shù)據(jù)均一性
 

4）準(zhǔn)確性：

NGS文庫制備的準(zhǔn)確性越高，你對變異報告的信任程度就越高。核苷酸錯誤通常在PCR擴增以及測序過程中引入。測序錯誤通常低于1%。通過使用高保真PCR試劑，可盡量減少文庫擴增的錯誤。NGS對照樣品也有助于評估NGS流程的準(zhǔn)確性。

圖3.PCR擴增存在一定的錯配率

 

5）測序深度和覆蓋度：

假設(shè)對長1000 bp的目標(biāo)區(qū)域進行捕獲測序，每個read長10 bp，總共得到3000個reads，把所有的reads對比到目標(biāo)區(qū)域后，1000 bp的目標(biāo)區(qū)域中有990 bp的位置至少有1個read覆蓋到，換言之剩余的10bp沒有1個read覆蓋。

則此時：

測序深度（depth）3000*10/1000=30 也就是說測序深度為30*

覆蓋度（coverage）990/1000*100%=99% 這次測序覆蓋度為99%

 

同理：

假設(shè)對長100bp的目標(biāo)區(qū)域進行捕獲測序，每個read長5bp，總共得到200個reads，把所有的reads對比到目標(biāo)區(qū)域后，100bp的目標(biāo)區(qū)域中有98bp的位置至少有1個read覆蓋到，換言之剩余的2bp沒有1個read覆蓋。

深度（depth）200*5/1000=10 也就是說測序深度為 10*

覆蓋度（coverage）98/100*100%=98% 這次測序覆蓋度為98%
 

文庫構(gòu)建中的哪些步驟會直接影響測序質(zhì)量？
 

NGS的最終目的就是得到優(yōu)秀測序數(shù)據(jù)助力于下游科學(xué)研究或?qū)嶋H應(yīng)用，其中文庫構(gòu)建是測序數(shù)據(jù)的重要影響因素，文庫構(gòu)建一般包括以下幾類步驟（以DNA為例）：樣本片段化、接頭連接、分選/純化、文庫擴增。文庫對測序數(shù)據(jù)的影響，具體到文庫構(gòu)建的每個步驟，參考表2。

表2.建庫步驟對測序結(jié)果的影響

步驟	評估指標(biāo)	對測序結(jié)果的影響
樣本片段化	打斷隨機性	文庫質(zhì)量；測序數(shù)據(jù)的均一性和覆蓋度
	片段大小是否集中	文庫濃度；測序數(shù)據(jù)覆蓋度
接頭連接	接頭連接效率	文庫轉(zhuǎn)化率；文庫復(fù)雜度；均一性；準(zhǔn)確性和覆蓋度
分選/純化	片段大小的一致性	片段大小與測序儀大小不匹配將無法上機測序
	回收效率	文庫濃度；測序數(shù)據(jù)覆蓋度
文庫擴增	擴增偏好性	文庫復(fù)雜度；均一性
	擴增效率	文庫濃度；文庫復(fù)雜度