案例分享|質(zhì)粒提取的常見問題和解決方案！
柱式法質(zhì)粒提取的原理
柱式法質(zhì)粒提取主要基于SDS-堿裂解法。細(xì)胞在高pH的強陰離子洗滌劑SDS作用下，細(xì)胞壁被裂解，染色體DNA和蛋白質(zhì)發(fā)生變性并相互纏繞形成大型復(fù)合物。這些復(fù)合物在鉀離子取代鈉離子時從溶液中沉淀下來，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中。由于DNA帶負(fù)電，質(zhì)粒提取柱中的硅基質(zhì)膜在高鹽條件下能選擇性地吸附DNA。通過去離子水洗脫，最終得到純化的質(zhì)粒DNA。
質(zhì)粒提取的每種試劑關(guān)鍵成分是什么呢？今天我們來大揭秘
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組分 |
關(guān)鍵成分和功能 |
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緩沖液 RS*（P1） |
關(guān)鍵成分:25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、50mM 葡萄糖 功能:將菌體沉淀懸浮起來，有助于后續(xù)實驗進(jìn)行。 注:在使用緩沖液 RS*之前，需要添加 RNase A，該酶的作用是降解溶液中的 RNA |
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裂解液 LB（P2） |
關(guān)鍵成分:250mM NaOH、1%(W/V)SDS(十二烷基硫酸鈉) 功能:細(xì)胞進(jìn)行裂解 |
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結(jié)合液 BD（P3） |
關(guān)鍵成分:3M醋酸鉀（potassium acetate）和5M醋酸 功能:中和NaOH，并清除蛋白質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì) |
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漂洗液 W* |
關(guān)鍵成分:10mM Tris-HCl(pH7.5)、80%乙醇(Ethanol) 功能:去除DNA提取過程中產(chǎn)生的多余鹽離子 |
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洗脫液 |
關(guān)鍵成分:10mM Tris-HCl（pH7.5）的溶液 功能:幫助DNA從硅膠柱中洗脫出來 |
質(zhì)粒提取之后，如何評估質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量呢？
目前使用分光光度法定量質(zhì)粒DNA和通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)粒DNA產(chǎn)率和質(zhì)量的分析是兩種最常用的方法。
舉例：提取2 mL過夜培養(yǎng)的大腸桿菌PUC19質(zhì)粒，分光光度法檢測質(zhì)粒的得率，在15 μg左右，260/280=1.8~2.0，260/230=2.0~2.3；瓊脂糖凝膠電泳顯示三條帶，從上至下依次為：開環(huán)DNA、線性DNA、超螺旋DNA，其中超螺旋DNA的占比＞90%。
質(zhì)粒提取常見問題案例梳理
出現(xiàn)嚴(yán)重的RNA污染
如圖所示，質(zhì)粒提取之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)明顯的RNA條帶，說明有RNA污染。
原因及解決方法：
（1）未在緩沖液 RS*中事先加入RNase A。解決方法：補加RNase A。
（2）加入RNase A的緩沖液 RS*長期保存于室溫，導(dǎo)致RNase A活性下降。解決方法：每次使用后置于 4℃保存。若長期不用，置于-20℃保存。
（3）細(xì)菌過量,RNase A不能有效降解RNA。解決方法：將細(xì)菌用量減半或增加RNase A在緩沖液 RS*中的濃度。
出現(xiàn)基因組污染
（1）菌體裂解和中和過程中,劇烈混合造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：溫和地進(jìn)行菌體的裂解和中和。
（2）加裂解液 LB時操作時間過長，造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：將裂解步驟控制在5分鐘內(nèi)完成。
（3）細(xì)菌的質(zhì)量差（反復(fù)凍融的細(xì)菌，陳舊的細(xì)菌，培養(yǎng)條件不合適的細(xì)菌等）中有許多斷裂或降解而游離的基因組DNA，使用生長良好的新鮮細(xì)菌。
超螺旋質(zhì)粒比例低
如圖右所示，質(zhì)粒提取之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，開環(huán)質(zhì)粒的占比約20%，說明超螺旋比例低，一般超螺旋比例需要＞90%，一般來說超螺旋比例越高，質(zhì)粒的穩(wěn)定性越高，高超螺旋比例的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染效率、基因表達(dá)水平等方面具有更好的表現(xiàn)。
原因：裂解時間不宜過長，加入裂解液后裂解時間不應(yīng)超過5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞
解決方法：優(yōu)化裂解時間；確保質(zhì)粒的結(jié)合和所有溶液都在室溫下進(jìn)行，減少離心力對質(zhì)粒超螺旋結(jié)構(gòu)的影響，因為過度的離心可能會破壞質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)。
內(nèi)毒素殘留高
常規(guī)質(zhì)粒DNA純化中，質(zhì)粒DNA仍需要從55%蛋白質(zhì)、20%RNA、3%內(nèi)毒素和3%基因組DNA中分離，在質(zhì)粒DNA制備的菌體裂解過程中，內(nèi)毒素分子被釋放到溶菌液中。由于內(nèi)毒素常形成囊狀結(jié)構(gòu)，其分子量、電荷性和疏水性都與質(zhì)粒DNA相似，常用的純化方法很難將內(nèi)毒素與質(zhì)粒DNA分開。內(nèi)毒素會降低原代細(xì)胞和敏感培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，干擾免疫細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染。由于實驗?zāi)康牟煌?，對質(zhì)粒DNA的內(nèi)毒素要求亦不同，尤其是在細(xì)胞轉(zhuǎn)染、基因沉默研究、基因治療等過程中，對質(zhì)粒質(zhì)量、內(nèi)毒素水平要求更為苛刻，對于非敏感型的的轉(zhuǎn)染實驗，要求內(nèi)毒素殘留0.1～2.5 EU/ug，對于敏感型的的轉(zhuǎn)染實驗，要求內(nèi)毒素殘留＜0.1 EU/ug。
原因：內(nèi)毒素去除時操作不當(dāng)或者未選擇合適的試劑
解決方法：
（1）如果采用的內(nèi)毒素清除的方法，離心之后，上層水相含DNA，下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì)。這時注意不要吸到藍(lán)色油狀層，里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì)。
（2）在使用樹脂純化系統(tǒng)去除內(nèi)毒素時，需要先活化樹脂，然后使用平衡緩沖液平衡樹脂，以確保最佳的去除效率。
翌圣生物的質(zhì)粒提取試劑盒，歷經(jīng)市場多年的磨礪與錘煉，產(chǎn)品成熟而穩(wěn)定。產(chǎn)品品質(zhì)，不僅贏得了廣泛的認(rèn)可與贊譽，更累積了超過300的影響因子總分?jǐn)?shù)，成為眾多科研工作者的首選！
產(chǎn)品推薦
柱式法
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
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19021ES50/ES70 |
MolPure® Endo-free Plasmid Mini Kit 無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒 |
50T/200T |
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19001ES50/ES70 |
MolPure® Plasmid Mini Kit 質(zhì)粒小量提取試劑盒 |
50T/200T |
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19036ES10 |
MolPure® Endo-free Plasmid Maxi Kit 無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒 |
10T |
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19101ES50/ES70 |
MolPure® Gel Extraction Kit 瓊脂糖凝膠回收試劑盒 |
50T/200T |
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19106ES50/ES70 |
MolPure® PCR Purification Kit PCR產(chǎn)物純化試劑盒 |
50T/200T |
磁珠法
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
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18538ES50/ES70 |
MolPure® Magnetic Plasmid Mini Kit 磁珠法質(zhì)粒小量提取 |
50 T/200 T |
磁珠，瓶裝 |
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18539ES16/48 |
MolPure® Mag16/48 Plasmid Mini Kit（Prepackaged） |
16 T/48T |
磁珠16/48預(yù)裝，適配AP-16S和AP-48 |
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18541ES96 |
MolPure® Mag96 Plasmid Mini Kit （Prepackaged）磁珠法96孔質(zhì)粒小量提取試劑盒（預(yù)封裝） |
96T |
磁珠96預(yù)裝，適配AP-96N |
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18542ES48 |
18542ES MolPure® Magnetic Endo-free Plasmid Mini Kit 磁珠法去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒 |
48 T |
磁珠，瓶裝 |
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18543ES24/ES48 |
18543ES MolPure® Magnetic Plasmid med Kit 磁珠法質(zhì)粒去內(nèi)毒素中量提取試劑盒 |
24T/48 T |
磁珠，瓶裝 |
