“同源重組技術(shù)” 一步法快速克隆技術(shù)常見問題集
過去
提起“分子克隆”或“載體構(gòu)建”這兩個詞，大家可能先想到的是傳統(tǒng)“酶切酶連法”，即用限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生黏性末端，通過堿基互補配對，T4 DNA Ligase連接兩個片段的克隆方法。
近年
“同源重組技術(shù)”逐漸受到科研人員的歡迎，如翌圣Hieff Clone®一步法快速克隆技術(shù)。相比之下，同源重組技術(shù)操作更加簡單，不受到酶切位點的限制，可一次進行多個片段的拼接，大大的提高了克隆效率。
雖然同源重組技術(shù)操作簡單，但畢竟實驗過程是環(huán)環(huán)相扣的，一旦某個細節(jié)處理不好，都可能導(dǎo)致實驗失敗。為此，小編精心整理了同源重組實驗的常見問題，并給出了可能的原因和解決方案。希望新手們在遇到類似問題時可快速判斷可能的原因，節(jié)省時間，更順利的完成實驗。
常見問題分類：
無克隆、假陽性、菌落PCR無條帶、酶切鑒定多條帶
出現(xiàn)無克隆的現(xiàn)象，可能的原因主要是連接不成功或連接成功，但轉(zhuǎn)化失敗。具體原因分別如下：
1、 連接不成功
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可能原因 |
解決方法 |
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1）引物設(shè)計錯誤。 |
1）設(shè)計原則：同源臂（15-25 bp，GC含量40-60%）+酶切位點(根據(jù)實驗需求保留或刪除)+基因特異性引物。 2）判斷方法：可用翌圣無縫克隆引物設(shè)計軟件核對 |
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2）載體與目的片段使用比例失調(diào)。 |
1）載體和目的片段濃度測定方法：常用吸光度法或瓊脂糖電泳法。 2）載體與目的片段添加比例： ①單片段建議：最適載體與目的片段摩爾比為1:2-1:3，載體使用量為0.03 pmol；目的片段使用量為0.06-0.09 pmol。 ②多片段建議：最適DNA使用量為每片段（含線性化載體）0.03 pmol。 |
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3）載體與目的片段不純。 |
1）推薦對線性化載體、PCR產(chǎn)物進行膠回收純化。 2）純化產(chǎn)物建議溶解在pH8.0的ddH2O中保存。 3）若為未純化的DNA，加入總體積不超過反應(yīng)體系體積1/5。 |
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4）操作問題或試劑盒失效。 |
建議做試劑盒附帶的陽性對照實驗。判斷方法： 1）若陽性對照有克隆并檢測為陽性，則排除試劑盒問題。 2）若陽性對照無克隆，可能是操作問題或試劑盒失效，建議換其他人或換試劑盒進行陽性對照實驗，進一步確定問題。 |
2、 連接成功，但無克隆
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可能原因 |
解決方法 |
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1）感受態(tài)細胞效率低，如＜ 107 cfu/μg。 |
建議用轉(zhuǎn)化效率＞107 cfu/μg的感受態(tài)細胞。 判斷方法：可轉(zhuǎn)化0.1ng質(zhì)粒（如PUC19），觀察克隆數(shù)，若生長大于1000個菌斑，則轉(zhuǎn)化效率大于107cfu/μg。 |
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2）抗生素種類錯誤。 |
建議將未線性化載體轉(zhuǎn)化涂板。 判斷方法：若未長克隆，則可能是抗性種類錯誤或濃度過高。需檢查質(zhì)粒圖譜確認抗性或確認最適濃度。 |
出現(xiàn)假陽性的情況，主要表現(xiàn)有兩種，克隆不含插入片段或含有錯誤的插入片段。具體原因分別如下：
1、克隆不含插入片段（空載）
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可能原因 |
解決方法 |
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1）載體線性化不完全。 |
建議將已制備的線性化的載體轉(zhuǎn)化涂板。 判斷方法：如果長克隆較多，則表示線性化不完全。建議優(yōu)化酶切體系。 |
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2）體系中混入了相同抗性的環(huán)狀質(zhì)粒。 |
1）產(chǎn)生原因： ①以反向PCR方式進行載體線性化，殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板導(dǎo)致。 ②目的基因PCR模板為與載體相同抗性的環(huán)狀質(zhì)粒，殘留環(huán)狀 質(zhì)粒模板導(dǎo)致。 2）判斷方法：將已制備的線性化載體和目的片段分別轉(zhuǎn)化涂板，如果長克隆較多，則表示有相同抗性的環(huán)狀質(zhì)?；烊?。建議PCR擴增產(chǎn)物先用DpnI 消化模板后，再進行膠回收純化處理或直接進行膠回收純化處理，去除殘留的環(huán)狀模板質(zhì)粒導(dǎo)致的假陽性。 |
2、克隆含有錯誤的插入片段
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可能原因 |
解決方法 |
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1）PCR產(chǎn)物混有非特異擴增產(chǎn)物。 |
1）可能情況：PCR擴增目的基因時有非特異條帶出現(xiàn)，未進行膠回收純化。 2）解決方案： ①優(yōu)化PCR體系，提高特異性； ②膠回收PCR產(chǎn)物； ③鑒定更多的克隆。 |
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2）片段缺失。 |
1）可能情況：載體或片段有多個同源重復(fù)序列。 2）解決方案：借助網(wǎng)站或軟件進行序列比對（如NCBI， Vector NTI等）。 |
出現(xiàn)菌落PCR無條帶的現(xiàn)象，可能與PCR擴增或重組連接有關(guān)，具體原因分別如下：
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可能原因 |
解決方法 |
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1）菌落PCR引物錯誤。 |
建議用載體的通用引物進行菌檢，或至少使用一條通用引物。 |
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2）PCR體系或程序不合適。 |
1）可能情況：用目的片段引物和載體通用引物擴增都無產(chǎn)物。 2）解決方案： ①優(yōu)化PCR體系、程序； ②提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗證； ③換酶切法鑒定克隆。 |
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3）連接失敗。 |
1）判斷方法：目的引物或一端載體通用引物，另一端目的引物擴增無條帶，但載體通用引物擴增有條帶，且大小符合空載。2）可能原因：載體線性化不完全。建議優(yōu)化酶切體系。 |
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可能原因 |
解決方法 |
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重組載體上有多個相同的酶切位點。 |
1）換其他酶切位點進行酶切鑒定。 2）更換克隆鑒定方法，如換成菌落PCR或測序鑒定。 |
以上就是翌圣生物為大家整理的同源重組的常見問題及相應(yīng)的建議，希望對大家有所幫助。如果還有其它更多關(guān)于同源重組的問題，歡迎留言或來電。如果您之前在用傳統(tǒng)酶的切酶連技術(shù)，現(xiàn)對高效的同源重組技術(shù)躍躍欲試，那趕快行動起來吧！
翌圣生物將提供高體驗滿意度的產(chǎn)品解決方案作為責(zé)任，追求從實驗操作者的視角考量產(chǎn)品性能！在此考量下，為大家推薦以下匠心出品——Hieff CloneTM克隆系列產(chǎn)品。該系列產(chǎn)品克隆效率顯著提升，可達95%以上。基于同源重組的方式，該系列產(chǎn)品無需考慮酶切位點，適用于任何載體和任意片段的連接。同時兼具連接反應(yīng)時間短（20 min）、操作簡單等優(yōu)勢。
產(chǎn)品定位
Hieff CloneTM一步法克隆
產(chǎn)品優(yōu)勢
● 無需考慮酶切位點：不受插入片段酶切位點的限制，適用于任何載體；插入片段兼容粘性或平末端。
● 設(shè)計簡單：在插入片段的PCR擴增引物5’端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可。
● 快速：50℃，20 min即可完成重組反應(yīng)?？寺￡栃月士蛇_95%以上。
● 應(yīng)用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆，也可結(jié)合Canace高保真酶，應(yīng)用于定點突變。
客戶反饋數(shù)據(jù)
高效、快速單片段連接
注. A: 陰性對照轉(zhuǎn)化平板; B: 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板; C: 1和2分別為原始載體和線性化載體濃度檢測電泳圖; D: 目的片段的濃度檢測電泳圖; E: 目的片段的菌落PCR鑒定電泳圖; F: 1為重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖, 2為原始質(zhì)粒酶切對照圖; M: DL10000。pCAMBIA1300載體: 10217bp, 目的片段: 2352bp。
高效、快速多片段連接
注. A: 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板; B: 1為載體酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖; C: 菌落PCR驗證結(jié)果, 其中1為原始質(zhì)粒對照電泳, 2-5為重組質(zhì)粒, 僅檢測867bp的一個目的片段, 6為假陽性; D: 陽性克隆測序結(jié)果; M：Marker II。pBR322載體：3996bp，目的片段：576bp+867bp+915bp+647bp。
發(fā)表部分文獻
[1]. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019.（IF 36.616）
[2]. Wang Y, Hu SB, et al. Genome-wide screening of NEAT1 regulators reveals cross-regulation between paraspeckles and mitochondria. Nat Cell Biol.2018 Oct;20(10):1145-1158.（IF 20.06）
[3]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017.（IF 37.205）
Hieff CloneTM TOPO克隆
產(chǎn)品優(yōu)勢
平末端和A末端PCR產(chǎn)物均可在瞬間（幾秒鐘-5分鐘）完成連接；
無需并與和熱休克，室溫5分鐘內(nèi)完成轉(zhuǎn)化；37℃ 10分鐘復(fù)蘇可以涂板；
客戶反饋數(shù)據(jù)
發(fā)表部分文獻
[1]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017.（IF 37.205）
[2]. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16.（IF 30.41）
[3] Li X, Liu C X, Xue W, et al. Coordinated circRNA biogenesis and function with NF90/NF110 in viral infection[J]. Molecular Cell, 2017. (IF 14.7)
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