核酸電泳是進(jìn)行核酸研究的重要手段，是分離、鑒定和純化核酸的主要方法。核酸電泳一般有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。瓊脂糖凝膠電泳因其分離范圍較廣，在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用更為廣泛。既然應(yīng)用的多，那么就可能會(huì)有各種各樣的使用差異導(dǎo)致的問(wèn)題。

 

下面小翌根據(jù)多年的售后經(jīng)驗(yàn)，精心為您整理了核酸電泳的常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案。助您輕輕松松做實(shí)驗(yàn)，大把時(shí)間寫(xiě)文章~

1. 無(wú)條帶

 

 

1) DNA條帶跑出凝膠，減少電泳時(shí)間。

解決辦法：電泳時(shí)，注意觀察溴酚藍(lán)跑到凝膠的2/3處即可停止電泳?？s短電泳時(shí)間或降低電壓或增強(qiáng)凝膠濃度。

2) 染料的激發(fā)波長(zhǎng)使用錯(cuò)誤，選用適合的激發(fā)波長(zhǎng)。

例如：核酸染料YeaRed（Cat NO.10202ES, Yeasen）最大激發(fā)波長(zhǎng)是300 nm左右，需用紫外成像儀檢測(cè)。YeaRed在可見(jiàn)光下激發(fā)（如藍(lán)光成像儀）很弱，會(huì)導(dǎo)致沒(méi)有條帶或條帶非常弱。

解決辦法：改用紫外激發(fā)檢測(cè)。

3) 凝膠中未加入染料或染料失效，更換新的染料，重新實(shí)驗(yàn)。

解決辦法：換一支新的染料進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)是否為核酸染料導(dǎo)致。

2. 條帶弱

 

 

1) 染料和核酸結(jié)合不充分導(dǎo)致大分子條帶弱，增加染料濃度或減少核酸上樣量。

可能原因：染料和核酸結(jié)合不充分導(dǎo)致大分子條帶弱。小分子條帶因核酸量小，很容易與核酸染料結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)，而大分子條帶與核酸染料結(jié)合未飽和，從而導(dǎo)致條帶弱些。

解決辦法：適量增加膠中核酸染料濃度或適當(dāng)減少核酸上樣量，以保證核酸染料與核酸結(jié)合充分。

 

圖1. 大分子條帶弱

2) 染料遷移影響小分子條帶弱，提高M(jìn)arker上樣量。

可能原因：染料遷移導(dǎo)致小分子條帶弱。例如，在染料飽和的情況下，由于核酸染料EB帶正電荷，核酸分子帶負(fù)電荷，二者在電場(chǎng)中的遷移方向相反，而小分子DNA跑在最前面，相對(duì)結(jié)合的染料更少些，所以條帶弱一些。

解決辦法：屬正?，F(xiàn)象，無(wú)需優(yōu)化。若想優(yōu)化，可適當(dāng)提高M(jìn)arker上樣量，選擇大小合適的Marker，調(diào)整電泳時(shí)間；或者可改為泡染法，泡染法不會(huì)受染料遷移的影響。

 

圖2. 小分子條帶弱

3) 樣品上樣量不夠，梯度提高樣品上樣量。

可能原因：樣品或Marker上樣量不夠。

解決辦法：根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行加樣，或者根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整加樣量。

 

圖3. 上樣量不足導(dǎo)致條帶弱

4) 樣品部分降解，重新更換新樣品實(shí)驗(yàn)。

a) 可能原因：核酸酶污染導(dǎo)致樣本降解。

解決辦法：不使用含有核酸酶的試劑和耗材，避免核酸酶污染。

b) 可能原因：泡染法染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

解決辦法：一般泡染法根據(jù)說(shuō)明書(shū)推薦時(shí)間進(jìn)行染色。

c) 可能原因：拍照前放置過(guò)久。

解決辦法：電泳后及時(shí)觀察、拍照。

d) 可能原因：Marker由于保存不當(dāng)降解。

解決辦法：按照說(shuō)明書(shū)推薦的保存方式進(jìn)行保存。

 

圖4. Marker降解

3. 條帶彌散

 

 

1) 瓊脂糖溶解不充分、膠未完全凝固，需充分溶解瓊脂糖，延長(zhǎng)凝膠時(shí)間。

可能原因：瓊脂糖溶解不充分，凝膠時(shí)間過(guò)短、膠未完全凝固，膠孔大小不均勻，導(dǎo)致核酸電泳速度不均勻，出現(xiàn)抹帶現(xiàn)象。

解決辦法：確認(rèn)膠徹底溶解后溶液透明清亮，無(wú)油狀。一般100 mL的1%瓊脂糖凝膠的凝膠時(shí)間為30-40 min。

【注】溶膠過(guò)程需避免水分蒸發(fā)，可通過(guò)重新定容進(jìn)行確認(rèn)。

 

 

圖5. 瓊脂糖溶解不充分導(dǎo)致的條帶彌散

2) 染料不均勻，配膠時(shí)需搖勻。

可能原因：核酸染料遷移的影響。因市面上的無(wú)毒核酸染料多為大分子結(jié)構(gòu)，若不均勻，容易使得同樣大小的DNA片段結(jié)合的核酸染料量不一樣，遷移的速度就會(huì)受到影響，從而形成抹帶。

解決辦法：加入核酸染料后充分搖勻或者改用泡染法。

【注】若懷疑問(wèn)題與核酸染料影響核酸遷移有關(guān)，可使用泡染法染色以確認(rèn)問(wèn)題是否與染料有關(guān)。如果染色后問(wèn)題依舊存在，可判斷問(wèn)題與染料無(wú)關(guān)?？蓢L試優(yōu)化其它條件。

 

圖6. 核酸染料不均勻?qū)е碌臈l帶彌散

3) 電壓過(guò)小，增加電壓至110-130V。

可能原因：電壓過(guò)小，使DNA條帶發(fā)生擴(kuò)散。

解決辦法：建議電壓為5-10V/cm，一般是110-130V，最高不超過(guò)150V。

4) 緩沖溶液使用次數(shù)過(guò)多，建議一次性使用。

可能原因：離子強(qiáng)度降低，PH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳結(jié)果。

解決辦法：經(jīng)常更換電泳緩沖液。

5) 上樣量過(guò)多，減少上樣量。

可能原因：上樣量過(guò)多會(huì)造成加樣孔超載，導(dǎo)致拖尾或者彌散。

解決辦法：一般情況下，5 mm寬的梳子可以加入0.5 µg的核酸，加樣量根據(jù)加樣孔的大小和核酸大小而定。因此根據(jù)瓊脂糖膠孔大小適當(dāng)?shù)恼{(diào)整核酸的上樣量。

6) 樣品部分降解。

可能原因與解決辦法參考“條帶弱”中樣品降解情況。

7) 瓊脂糖凝膠濃度不合適，根據(jù)分子量大小選擇合適膠濃度。

推薦參照瓊脂糖凝膠濃度對(duì)照表1：

 

 

整體原則是大片段選擇低濃度凝膠，用TAE緩沖電泳體系；小片段選擇高濃度凝膠，用TBE緩沖電泳體系。

4. 條帶彎曲或弧形

 

 

1) 電壓過(guò)大，推薦＜150V，最好110-130V。

可能原因：電壓過(guò)大，易導(dǎo)致條帶彎曲拖尾現(xiàn)象。

解決辦法：降低電泳電壓，建議電壓為5-10 V/cm，一般是110-130 V，最高不超過(guò)150 V。

2) 上樣量過(guò)高，梯度降低樣品上樣量。

可能原因：核酸分子上樣量過(guò)高，導(dǎo)致核酸與染料結(jié)合不充分，易導(dǎo)致條帶彎曲現(xiàn)象。

解決辦法：減少核酸上樣量，對(duì)于未知濃度的樣品，嘗試1/2或1/3的常用上樣量。對(duì)于Marker樣本，稀釋后效果更好。

以圖7中的Marker為例，左圖Marker上樣量：原液5 µL，大分子條帶彎曲、拖尾且分不開(kāi)。右圖：將Marker原液2 µL稀釋5倍加10 µL，條帶清晰不拖尾。

 

 

圖7. 左：大分子條帶彎曲拖尾分不開(kāi)，右:條帶分離清晰（Marker: 100 bp ladder）

3) 染料量不足，一般使用1×工作濃度。

可能原因：核酸染料量不足，導(dǎo)致核酸與染料結(jié)合不充分，易導(dǎo)致條帶彎曲現(xiàn)象。

解決辦法：一般根據(jù)說(shuō)明書(shū)推薦的核酸染料1×終濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，或適當(dāng)提高核酸染料使用的終濃度。

 

圖8. 左:彎曲拖尾分不開(kāi)（YeaRed核酸染料終濃度0.25×），右:大分子條帶分離清晰（YeaRed核酸染料終濃度：1×）

5. 樣品條帶與Marker之間指示大小不一致

 

 

1) 核酸染料不充足，一般使用1×工作濃度。

可能原因：核酸染料不充足，會(huì)發(fā)生遷移率誤差情況。

解決辦法：建議提高核酸染料的工作濃度.

2) 上樣量差異影響，建議樣品與Marker的上樣體積相近。

可能原因：Marker與樣本的上樣量差異，會(huì)引起較大遷移誤差。

解決辦法：樣品與Marker的上樣體積相近，更容易跑出理想的電泳結(jié)果。

6. Marker缺帶

 

 

1) 小分子條帶跑出凝膠導(dǎo)致缺帶，減少電泳時(shí)間。

解決辦法：適當(dāng)縮短電泳時(shí)間，降低電壓，或增加凝膠濃度。

2) 相近的大分子條帶分不開(kāi)導(dǎo)致缺帶，提升染料濃度或減少M(fèi)arker上樣量。

可能原因：Marker濃度比較高, 導(dǎo)致核酸與染料結(jié)合不充分。

解決辦法：稀釋后使用（參考圖7）。具體情況，根據(jù)Marker說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

 

好了，小翌今天的分享到這里就結(jié)束了~

祝大家實(shí)驗(yàn)順利！加油！科研人~

等等！

 

 

這里還有一個(gè)小秘密，一般核酸電泳以Marker為分子標(biāo)記，如果以上內(nèi)容不能夠解決大家的核酸電泳問(wèn)題，有可能是你的核酸染料與Marker不兼容呢！可以嘗試更換相應(yīng)產(chǎn)品，判斷、解決問(wèn)題~

 

小翌這里推薦大家購(gòu)買Yeasen安全無(wú)毒核酸染料（Cat NO.10202ES）與相應(yīng)的Marker搭配使用更香哦！

 

 

相關(guān)產(chǎn)品
 

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號(hào)	規(guī)格
YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)	10202ES76	500 μL
2000 DNA Marker	10501ES60/80	100/1000 T
5000 DNA Marker	10504ES60/80	100 /10×100 T
100 bp DNA ladder	10507ES60/80	100 /10×100 T
1 kb DNA ladder	10510ES60/80	100 /10×100 T
Agarose瓊脂糖	10208ES60/76	100/500 g

HB201127