一、迷之疑惑“260/230”、“260/280”

 

 

“PCR”、“qPCR”、“逆轉(zhuǎn)錄”、“一代測(cè)序”、“RNA-seq”等核酸下游實(shí)驗(yàn)如此常見，似乎每一個(gè)進(jìn)行過這些實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員對(duì)“260/230比值”“260/280比值”都有一定的概念。但一千個(gè)讀者就有一千個(gè)哈姆雷特，各家實(shí)驗(yàn)室可能自帶一套流傳已久、自圓其說的比值范圍要求。

“1.8-2.0是比較好的，2.1有點(diǎn)偏高，有優(yōu)化的建議嗎？”

“有客戶反應(yīng)兩個(gè)吸光度比值偏高，達(dá)到2.1。” 

圖1. 客戶實(shí)驗(yàn)圖

“對(duì)于RNA濃度測(cè)定，那260/280的差異一般在哪里”（在交流[Molpure Cell RNA Kit，貨號(hào)19231]提取RNA結(jié)果時(shí)，某清華大學(xué)學(xué)生不禁發(fā)出了疑惑）

之所以出現(xiàn)上述疑惑，很大程度上，專業(yè)的試劑廠家也有不同的解讀。

表1. 不同試劑廠家對(duì)比值解讀

Thermo: It is important to note that the generally accepted 260/280 ratios of1.8 and 2.0 for DNA and RNA respectively, are "rules of thumb". The actual ratio will depend on the composition of the nucleic acid. The 260/230 values for “pure” nucleic acid are often higher than the respective 260/280 values. Expected 260/230 values are commonly in the range of 2.0-2.2.

 

NEB: In buffered solutions, pure dsDNA has an A₂₆₀/A₂₈₀ of 1.85–1.88 and pure RNA has a ratio of around 2.1. In buffered solutions, pure dsDNA has slightly higher A₂₆₀/A₂₃₀ ratios than RNA, with a value of 2.3–2.4 commonly reported for dsDNA and 2.1–2.3 for RNA. A₂₆₀/A₂₃₀ ratios typically produce a higher standard deviation than A260/A280 ratios and should be interpreted with care.

 

Qiagen: An A₂₆₀/A₂₈₀ ratio of 1.8–2.1 at pH 7.5 is widely accepted as indicative of highly pure RNA. Pure RNA should also yield an A₂₆₀/A₂₃₀ ratio of around 2 or slightly higher; however, there is no consensus on the acceptable lower limit of this ratio.

 

 

 

 

二、A₂₃₀、A₂₆₀和A₂₈₀都是啥、為啥要計(jì)算比值？

 

 

1、A₂₃₀、A₂₆₀和A₂₈₀

記不清是在物理課還是化學(xué)課上（理化不分家）學(xué)到的大名鼎鼎的“朗伯-比爾定律（Beer-Lambert law）”公式中，提出了吸光度值（absorbance，簡寫A）的概念，為了便于回憶，呈上公式：A=lg(1/T)=Kbc。

該公式是對(duì)下面客觀事實(shí)的總結(jié)：某一化學(xué)物質(zhì)可吸收一定波長的光，并且對(duì)光的吸收度（A）與此化學(xué)物質(zhì)的濃度（c）成正比。因此，可以利用吸光度的大小來測(cè)定某種物質(zhì)的濃度。

某一物質(zhì)在某一個(gè)特定波長下的吸光度可用A_n來表示。

現(xiàn)在我們都知道了，A₂₆₀代表核酸在最高吸收峰260nm波長處的吸光度值，即260nm處的核酸最易“表現(xiàn)”自己，通過檢測(cè)260nm處吸收的吸光度值最可評(píng)測(cè)純化雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA樣品的濃度（見圖2）。

圖2. 核酸吸光度譜

也可以看出核酸在220-300nm光譜范圍內(nèi)均可產(chǎn)生吸光度值，因此，核酸也有其對(duì)應(yīng)的A₂₃₀、A₂₄₀、A₂₈₀值等。

與A₂₆₀類似，蛋白及其他物質(zhì)各有各的吸收峰，我們需要關(guān)注到裂解液、結(jié)合液、漂洗液、洗滌液和洗脫液中會(huì)有TRIzol、硫氰酸胍、鹽酸胍等離液鹽、SDS、Triton X-100、Tween 20等去污劑、苯酚、EDTA、乙醇、異丙醇、NaCl等物質(zhì)。

因此，我們現(xiàn)在也熟知了A₂₈₀最能反映蛋白質(zhì)濃度（蛋白有多個(gè)吸收峰，A₂₈₀用的較多），A₂₃₀最能反映乙醇、GTC、GuHCl等的含量，A₂₇₀可用于苯酚濃度。

 

2、A₂₆₀/ A₂₈₀、A₂₆₀/ A₂₃₀比值

人們發(fā)現(xiàn)：“pure”DNA/RNA的吸光度值是可測(cè)量的，且“A₂₆₀/ A₂₈₀、A₂₆₀/ A₂₃₀比值”具有規(guī)律（見后續(xù)比值數(shù)據(jù)）。因此，約定俗成地認(rèn)為，比值在一定程度上可說明DNA、RNA的純度。但，這并不被NanoDrop廠家所認(rèn)可（我們?cè)?/span>干貨分享 | NanoDrop測(cè)定的核酸濃度值，真的可信嗎？一文中有提到）。

然而，測(cè)比值屬于核酸質(zhì)量評(píng)估最簡單快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的方法之一！

 

 

 

 

 

三、理性討論A₂₆₀/ A₂₈₀與A₂₆₀/ A₂₃₀的合理范圍

 

 

1、撇開濃度去談比值，純屬耍流氓

作為非利益方，美國NEB官方做過這樣的一個(gè)測(cè)試：“a dilution series DNA of 150ng/µl down to 1ng/µl in TE buffer was analyzed to measure concentration and purity ratios”，評(píng)估NanoDrop^® One（這臺(tái)儀器是Thermo家的）測(cè)定A₂₆₀/ A₂₈₀與A₂₆₀/ A₂₃₀的準(zhǔn)確性。

最終得出結(jié)論：當(dāng)?shù)陀?0ng/µl，A₂₆₀/ A₂₈₀、A₂₆₀/ A₂₃₀比值波動(dòng)非常大，應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待！當(dāng)高于50ng/µl，比值波動(dòng)小，測(cè)定值可信賴！

表2A. 不同濃度DNA A₂₆₀/ A₂₈₀比值

表2B. 不同濃度DNA A₂₆₀/ A₂₃₀比值

*注：數(shù)據(jù)來源NEB

 

2、要特別注意的提取污染物

考慮提取DNA、RNA時(shí)，洗脫液中或多或少會(huì)有提取試劑或樣本蛋白等的殘留物，這些物質(zhì)在220-300nm光譜處可形成吸光度譜，可能會(huì)與核酸吸光度譜疊加或不明趨勢(shì)地形成組合吸光度譜。這造成最終DNA/RNA測(cè)定的吸光度不能真實(shí)反應(yīng)比值！

圖3. 1M異硫氰酸胍鹽測(cè)定的濃度值及其A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀比值（注：異硫氰酸胍是TRIzol的主要成分）

 

有文獻(xiàn)報(bào)告，選擇性地?fù)饺?5-200mg/ml蛋白樣品到高、低濃度（25ng/µl和100ng/µl）DNA中，蛋白污染對(duì)于低濃度DNA的比值測(cè)定值影響極大?。ㄒ姳?）

表3. 蛋白質(zhì)污染程度對(duì)DNA比值測(cè)定的影響

*注：數(shù)據(jù)來源NEB 

 

3、DNA和RNA的比值

DNA中污染RNA或RNA中污染DNA，都會(huì)引起比值的偏差。這是因?yàn)?，組成DNA和RNA的A/T/C/G/U 5種核苷酸本身的A₂₆₀/ A₂₈₀比值不均一，而紫外吸光圖譜缺乏特異性，無法有效區(qū)分DNA和RNA。所以，高AT含量和高GC含量的核酸比值可能也會(huì)有偏差。

注1：5種核苷酸溶液A₂₆₀/ A₂₈₀比值：G，1.15；A，4.5；C，1.51; T，1.47; U，4.00。

注2：一般認(rèn)為，DNA中污染15-20%的總RNA，會(huì)造成A₂₆₀/ A₂₈₀升高——由1.8偏移到1.9，A₂₆₀/ A₂₃₀則會(huì)下降。

 

4、pH及鹽離子的影響

A=lg(1/T)=Kbc中明確了在一定離子濃度與pH值的溶液中測(cè)吸光度值，這說明兩者會(huì)影響吸光度值。因此，洗脫緩沖液的選擇非常重要。

酸性溶液或水溶液比弱堿性緩沖液（如Tris緩沖液，pH8.0）的A₂₆₀/ A₂₈₀值低0.3-0.4。并且后者測(cè)定的A₂₆₀/ A₂₃₀值變異度更小。

因此，核酸濃度及質(zhì)量評(píng)估時(shí)，應(yīng)注意核酸稀釋液和洗脫液保持一致！

 

5、核酸完整度的影響

RNA的糖環(huán)上比DNA糖環(huán)上多一個(gè)自由羥基，加上環(huán)境中大量的RNA酶，RNA更易出現(xiàn)降解的情況。RNA的完整度不建議用吸光度比值來判斷！

 

 

 

 

 

四、關(guān)注比值，更應(yīng)關(guān)注下游實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

 

 

A₂₆₀/ A₂₈₀和A₂₆₀/ A₂₃₀僅作為樣本質(zhì)量的參考指標(biāo)，不在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的比值對(duì)下游實(shí)驗(yàn)檢測(cè)或許不那么重要！

Qiagen公司提供了參考數(shù)據(jù)：

0.1mM硫氰酸胍摻入到RNA中，A₂₆₀/A₂₃₀會(huì)嚴(yán)重下降，但高達(dá)100mM硫氰酸胍摻入到RNA中，不影響后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄及qPCR結(jié)果。

那么，唯比值論的觀點(diǎn)，應(yīng)受到“以好的下游實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作為好的提取參數(shù)”觀點(diǎn)的挑戰(zhàn)！

 

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表4. Molpure^® Cell RNA Kit 純度高，無乙醇或其他殘留物污染。濃度測(cè)定準(zhǔn)確。

圖5. hGAPDH擴(kuò)增結(jié)果（內(nèi)參基因）

圖6. hBC6擴(kuò)增結(jié)果（低豐度基因，Ct值接近30）

 

產(chǎn)品信息

 

產(chǎn)品貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
19231ES50	MolPure® Cell RNA Kit 培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒	50 T

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