幾乎每個實(shí)驗(yàn)小白剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的時候都會做到PAGE實(shí)驗(yàn)，但是PAGE實(shí)驗(yàn)中用到的膠，你們真的了解嗎？它分離蛋白的原理是什么？PAGE膠里有哪些組分，這些組分的作用是什么？平常實(shí)驗(yàn)室手工配出來的膠跟在公司購買的膠有什么差別？帶著這些疑問跟著小翌一起學(xué)習(xí)蛋白電泳中的PAGE膠吧！

 

1．什么是PAGE？它的原理是什么？

PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳，polyacrylamide gel electrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)，主要用于蛋白質(zhì)分離。聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel）是由單體丙烯酰胺（scrylamide，Acr）和交聯(lián)劑N,N^，-亞甲基雙丙烯酰胺（N,N’-methylenebisacylamide，Bis）在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，這里的催化劑指的是過硫酸鈉（AP），加速劑指的是四甲基乙二胺（TEMED）利用PAGE膠進(jìn)行蛋白分離的依據(jù)是電泳遷移率和PAGE膠的分子篩作用。

PAGE膠一般由不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)組成，包括濃縮膠和分離膠，濃縮膠的濃度較小，孔徑較大，可以將樣品濃縮至一個狹窄的區(qū)帶，之后樣品到達(dá)濃度較高的分離膠，實(shí)現(xiàn)蛋白的分離。根據(jù)分離蛋白質(zhì)的類型PAGE可分為Native PAGE和SDS PAGE。

Native PAGE是指在不加入SDS和巰基乙醇等變性劑的情況下，對保持活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳，可使蛋白質(zhì)保持天然的形狀和電荷，蛋白分離的依據(jù)是電泳遷移率和PAGE膠的分子篩作用，其分離狀況跟蛋白質(zhì)的分子量大小、形狀和攜帶電荷量相關(guān)。Native PAGE電泳之后仍能保持蛋白質(zhì)酶等生物大分子的生物活性，對其鑒定具有重要意義。

SDS PAGE一般是指在PAGE膠的配制、電泳樣本、電泳緩沖溶液中加入陰離子去垢劑SDS的電泳技術(shù)，SDS可斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使蛋白分子去折疊，破壞蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)。在蛋白樣品中加入SDS，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合形成蛋白-SDS膠束，其所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，大大消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異，基本只跟蛋白質(zhì)分子量有關(guān)。

 

2．PAGE膠是如何配制的？

（1）配膠

PAGE膠的配制包括配膠和灌膠兩個步驟。要配制聚丙烯酰胺凝膠，首先就是要拿到具體的配方，根據(jù)表1所列舉配方準(zhǔn)備好配膠的試劑。

表1.PAGE凝膠配制的參考配方，具體配方各個實(shí)驗(yàn)室根據(jù)其實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)需求會有所不同

組分作用	組分名稱	危險性	10 mL分離膠			4 mL濃縮膠
			8%	10%	12%	5%
定容劑	H2O	無危害	5.3 mL	4.9 mL	4.4 mL	2.46 mL
單體/交聯(lián)劑	Acr- Bis（29：1）	Arc：經(jīng)皮膚和呼吸道傳染，毒性可累積，不易排毒； Bis：影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)	2 mL	2.5 mL	3 mL	0.5 mL
緩沖溶液	1.5 M Tris-HCl/SDS pH 8.8	SDS對呼吸道有刺激作用	2.5 mL	2.5 mL	2.5 mL	1(pH 6.8)
催化劑	10% AP	對黏膜、上呼吸道組織、眼睛和皮膚有極大危害性	0.1 mL	0.1 mL	0.1 mL	40 uL
加速劑	TEMED	強(qiáng)神經(jīng)毒性	6 uL	6 uL	6 uL	4 uL

根據(jù)需要檢測的蛋白大小選擇合適濃度的凝膠，按照圖1依次加入各組分，配制好分離膠，振蕩混勻。

（2）灌膠

玻璃膠板和制膠夾的下沿對齊后，夾緊，然后垂直卡在架子上，灌膠。先灌分離膠，灌入后加入1 mL異丙醇/dd H₂O，放置15-45 min使其凝固。在分離膠固定好之后，倒掉上層的異丙醇/dd H₂O，再按照表1配制濃縮膠，倒入玻璃板中間，再插入梳子，等候30 min，這樣PAGE凝膠就配制好了。

配制好的凝膠，最好立即用于電泳實(shí)驗(yàn)；或置于密封袋中， 4℃儲存，時間不要超過1星期。

 

3．預(yù)制膠與傳統(tǒng)自配膠的優(yōu)劣勢比較

說了這么多PAGE膠的知識，相信大家對PAGE膠都有了一定的了解了，現(xiàn)在的PAGE膠除了實(shí)驗(yàn)室自己配制，也可以購買市面上配制好的PAGE膠，稱之為預(yù)制膠。隨著勞動力的增值，人們越來越傾向于購買品質(zhì)穩(wěn)定的預(yù)制膠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。相對于傳統(tǒng)自配膠，預(yù)制膠具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1）節(jié)省實(shí)驗(yàn)人員的寶貴時間：不用再配制N種溶液，還要灌膠、等膠凝固。

2）品質(zhì)穩(wěn)定：大規(guī)模生產(chǎn)的預(yù)制膠質(zhì)量穩(wěn)定，重復(fù)性好，可以有效避免自己配膠時好時壞的情況。

3）避免直接接觸有毒物質(zhì)：PAGE膠的成分大多數(shù)都是有毒的

 

聽到這里是不是有點(diǎn)心動了呢？ （更多詳情點(diǎn)擊）

 

附表：不同濃度的預(yù)制膠適合的蛋白質(zhì)分子量范圍

原則上高分子量用低濃度膠，低分子量蛋白用高濃度膠；如果分離蛋白范圍較廣，選用梯度預(yù)制膠會達(dá)到較好的分離效果。

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品編號	規(guī)格
Precast Protein Plus Gel,8%,10 wells,Hepes-Tris 8%高分辨率預(yù)制膠(Hepes-Tris)，10孔	36245ES10	1 盒（10 塊）
Precast Protein Plus Gel,10%,10 wells,Hepes-Tris 10%高分辨率預(yù)制膠(Hepes-Tris)，10孔	36246ES10	1 盒（10 塊）
Precast Protein Plus Gel,12%,10 wells,Hepes-Tris 12%高分辨率預(yù)制膠(Hepes-Tris)，10孔	36247ES10	1 盒（10 塊）
Precast Protein Plus Gel,15%,10 wells,Hepes-Tris 15%高分辨率預(yù)制膠(Hepes-Tris)，10孔	36248ES10	1 盒（10 塊）
Precast Protein Plus Gel,4-12%,10 wells,Hepes-Tris 4-12%高分辨率預(yù)制膠(Hepes-Tris)，10孔	36249ES10	1 盒（10 塊）
Precast Protein Plus Gel,4-20%,10 wells,Hepes-Tris 4-20%高分辨率預(yù)制膠(Hepes-Tris)，10孔	36250ES10	1 盒（10 塊）
Precast Protein Plus Gel,8%,15 wells,Hepes-Tris 8%高分辨率預(yù)制膠(Hepes-Tris)，15孔	36251ES10	1 盒（10 塊）
Precast Protein Plus Gel,10%,15 wells,Hepes-Tris 10%高分辨率預(yù)制膠(Hepes-Tris)，15孔	36252ES10	1 盒（10 塊）
Precast Protein Plus Gel,12%,15 wells,Hepes-Tris 12%高分辨率預(yù)制膠(Hepes-Tris)，15孔	36253ES10	1 盒（10 塊）
Precast Protein Plus Gel,15%,15 wells,Hepes-Tris 15%高分辨率預(yù)制膠(Hepes-Tris)，15孔	36254ES10	1 盒（10 塊）
Precast Protein Plus Gel,4-12%,15 wells,Hepes-Tris 4-12%高分辨率預(yù)制膠(Hepes-Tris)，15孔	36255ES10	1 盒（10 塊）
Precast Protein Plus Gel,4-20%,15 wells,Hepes-Tris 4-20%高分辨率預(yù)制膠(Hepes-Tris)，15孔	36256ES10	1 盒（10 塊）
Precast Running Buffer, 2 L (Powder) 變性蛋白預(yù)制膠緩沖液（粉末）	36257ES01	1 包
Precast Running Buffer for Native PAGE, 2 L (Powder) 天然蛋白預(yù)制膠緩沖液（粉末）	36258ES01	1 包

 

相關(guān)產(chǎn)品推薦

產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格
GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker（10-180 kDa）三色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)	20351ES76	2X250 μL
GoldBand 3-color High Range Protein Marker（10-245 kDa）三色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)	20352ES76	2X250 μL