在NGS領(lǐng)域，tn5酶算是明星了，不管是表觀建庫(kù)如ATAC-seq、CUT&Tag還是在極速建庫(kù)領(lǐng)域抑或是一步法建庫(kù)技術(shù)等等的應(yīng)用都頗為廣泛，完全是主角的存在。那tn5酶是怎么完成建庫(kù)的呢？各位看官請(qǐng)聽(tīng)小翌詳說(shuō)。

 

原始Tn5酶是由兩個(gè)1.5 kb的IS50插入序列夾帶的抗生素耐藥區(qū)組成，IS50L和IS50R。它是通過(guò)多步驟酶切-粘貼機(jī)制行使功能。具體為：兩分子tn5轉(zhuǎn)座酶單體首先結(jié)合到IS50元件末端的兩個(gè)19 bp區(qū)域（OE序列和IE序列），然后通過(guò)二聚體形成突觸復(fù)合體；轉(zhuǎn)座酶促進(jìn)重組的三個(gè)核心步驟
 

1.這些蛋白可以識(shí)別移動(dòng)元件末端的特定DNA序列，并將它們配對(duì)形成突觸復(fù)合體；

2.這些蛋白在元件的每一端切割DNA，將元件的3'OH端從嵌入的DNA中解放出來(lái)；

3.這些蛋白促進(jìn)新的DNA位點(diǎn)上的末端的兩個(gè)磷酸二酯鍵被攻擊，從而將元件的基因組連接到新的DNA片段。水在裂解階段扮演親核試劑的攻擊角色，而元件的3 '羥基在DNA連接階段(稱為DNA鏈轉(zhuǎn)移)扮演親核試劑的角色[1]。

圖1.Tn5轉(zhuǎn)座機(jī)制[2]

 

 Tn5發(fā)展到現(xiàn)在，人們已經(jīng)能夠利用Tn5進(jìn)行體外酶切實(shí)驗(yàn)，也是我們現(xiàn)在利用Tn5酶來(lái)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建的方式。研究者發(fā)現(xiàn)，體外Tn5實(shí)驗(yàn)，只需要核心序列（ME：CTGTCTCTTATACACATCT）、Tn5轉(zhuǎn)座酶以及Mg2+就能夠行使Tn5 ”剪切-復(fù)制”功能。因而利用這種原理，科學(xué)家們將含測(cè)序接頭序列一致的序列添加到ME序列中，在轉(zhuǎn)座酶“剪切-復(fù)制”時(shí)，將ME序列插入靶DNA序列的同時(shí)，加上測(cè)序序列，從而在后續(xù)建庫(kù)擴(kuò)增過(guò)程中，實(shí)現(xiàn)一步法PCR建庫(kù)就能獲得完整的用于測(cè)序的文庫(kù)。

 

圖2.含不同測(cè)序引物的tn5酶應(yīng)用場(chǎng)景[2]

當(dāng)然，Tn5酶雖然有這么強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，但是也有一定的缺陷，就是Tn5酶在“剪切”位點(diǎn)末端，具有9bp的堿基偏好性。那看到這里，可能會(huì)有人問(wèn)，既然有堿基偏好性，Tn5酶是不是像常用的限制性內(nèi)切酶一樣有識(shí)別位點(diǎn)呢？為什么我們一直說(shuō)Tn5酶是隨機(jī)切割呢？實(shí)際上，Tn5酶確實(shí)是有識(shí)別位點(diǎn)，但是識(shí)別位點(diǎn)并非像限制性內(nèi)切酶一樣序列特異。目前共識(shí)的Tn5/IS50目標(biāo)位點(diǎn)為A-GNTYWRANC-T。
當(dāng)然，看到這里，可以還是有人會(huì)問(wèn)，那我們做像ATAC、CUT&tag這樣的表觀實(shí)驗(yàn)，如果Tn5有目標(biāo)識(shí)別序列，是不是效果就不太好？這里又得說(shuō)到Tn5轉(zhuǎn)座的另一個(gè)特性，就是它會(huì)優(yōu)先整合到主動(dòng)轉(zhuǎn)錄或高度超卷曲的DNA區(qū)域中，這種特性就與序列特異性無(wú)關(guān)，而是與靶標(biāo)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有關(guān)[3]。

講了這么多的原理，那在Tn5建庫(kù)過(guò)程中，含有ME序列和接頭序列的包埋序列，是如果進(jìn)行建庫(kù)的呢？

我們以常用的含Illumina測(cè)序adapter的ME為例，來(lái)給大家詳細(xì)講解吧。

首先，隆重出場(chǎng)的是轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體。轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體是由兩分子的Tn5轉(zhuǎn)座酶加兩端DNA序列，具體情況見(jiàn)下圖：

 

圖3.Tn5轉(zhuǎn)座酶結(jié)構(gòu)

 

轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體組合后，我們就可以進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建了，Tn5轉(zhuǎn)座復(fù)合體進(jìn)行“剪切-復(fù)制”的過(guò)程中，會(huì)在靶DNA處產(chǎn)生一個(gè)9bp的gap，在文庫(kù)構(gòu)建的PCR階段，需要先進(jìn)行72℃的延申步驟來(lái)補(bǔ)平gap，具體步驟見(jiàn)下圖：
 

 

圖4.Tn5文庫(kù)構(gòu)建流程

 大家對(duì)Tn5酶進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建是否明白了呢？

[1] Rice P A ,  Baker T A . Rice PA, Baker TA. Comparative architecture of transposase and integrase complexes. Nat Struct Biol 8: 302-307[J]. Nature Structural Biology, 2001, 8(5):302-307.

[2] Li N ,  Jin K ,  Bai Y , et al. Tn5 Transposase Applied in Genomics Research[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(21):8329.

[3]Goryshin,  Igor Y , Miller, et al. Tn5/IS50 target recognition.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1998.