無縫克隆因具有不受酶切位點限制、可以在質(zhì)粒的任何位點進(jìn)行一個或多個DNA片段插入的特點而備受科學(xué)家們青睞。Taq DNA ligase作為無縫克隆的關(guān)鍵酶之一，在其中發(fā)揮了不可替代的作用。

 

什么是Taq DNA ligase

Taq DNA ligase來源于嗜熱菌Thermus thermophilus HB8，是一種耐高溫連接酶，以NAD⁺為輔酶因子，在45℃-65℃范圍內(nèi)均有活性。能催化與同一互補(bǔ)靶DNA鏈雜交的兩條相鄰寡核苷酸鏈的5´-磷酸和3´-羥基之間形成磷酸二酯鍵。該催化反應(yīng)只有當(dāng)兩條寡核苷酸鏈與互補(bǔ)靶DNA完全配對，且兩條寡核苷酸鏈之間沒有間隙的條件下才會發(fā)生。

 

Taq DNA ligase的應(yīng)用

1.無縫克隆^[1]

2.SNP基因分型檢測^[2]

3.全基因合成擴(kuò)增^[3]

4.NGS建庫中nick連接

 

Taq DNA ligase在無縫克隆中的應(yīng)用

無縫克隆依賴于dsDNA的黏性末端進(jìn)行互補(bǔ)配對，與傳統(tǒng)克隆不同的是無縫克隆采用外切酶來產(chǎn)生粘性末端。T5核酸外切酶能夠沿著5’→3’方向，降解dsDNA，從而產(chǎn)生黏性末端。但T5外切酶并不能保證每一個片段5’端都會酶切成一樣長的粘性末端，退火之后可能會產(chǎn)生缺失的堿基。因此退火之后，無縫克隆中的DNA聚合酶會針對缺失的堿基進(jìn)行添加，Taq DNA ligase催化堿基之間形成磷酸二酯鍵，將所有缺口補(bǔ)齊。

 

 

圖1. 無縫克隆原理圖

 

翌圣Hieff^® Taq DNA ligase在野生型的基礎(chǔ)上進(jìn)行定向改造，具有更高的連接效率，應(yīng)用于無縫克隆性能較野生型得到顯著提高。

 

性能展示

 

1.超高連接效率

使用翌圣及競品N*的Taq DNA ligase進(jìn)行無縫克隆，結(jié)果如圖2所示，翌圣Hieff^® Taq DNA ligase具有更高的陽性克隆率。

 

圖2. 翌圣及N* Taq DNA ligase無縫克隆電泳檢測結(jié)果

 

 

2.低殘留

瓊脂糖凝膠電泳檢測Hieff^®  Taq DNA ligase無切口酶、外切酶及RNase殘留。

 

圖3. 切口酶、外切酶及RNase殘留檢測結(jié)果

 

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參考文獻(xiàn)

1. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA 3rd, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 2009;6(5):343-345. doi:10.1038/nmeth.1318

2. Li Y, Wark AW, Lee HJ, Corn RM. Single-nucleotide polymorphism genotyping by nanoparticle-enhanced surface plasmon resonance imaging measurements of surface ligation reactions. Anal Chem. 2006;78(9):3158-3164. doi:10.1021/ac0600151

3. Bang D, Church GM. Gene synthesis by circular assembly amplification. Nat Methods. 2008;5(1):37-39. doi:10.1038/nmeth1136