產(chǎn)品說明書
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COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品簡介
MolPure® Magnetic Plasmid Mini Kit采用堿裂解法裂解細(xì)胞，通過獨(dú)特的磁珠和精心優(yōu)化的緩沖體系從菌體中提取純化高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，提取過程中不需要用到有毒的酚氯仿等有機(jī)物。本試劑盒適用于提取1-5 mL過夜培養(yǎng)的大腸桿菌，質(zhì)粒提取得率和質(zhì)量與質(zhì)?？截悢?shù)、宿主菌種類以及細(xì)菌培養(yǎng)條件等因素相關(guān)。從2 mL過夜培養(yǎng)的菌液中一般能夠獲得8-12 μg的高質(zhì)量質(zhì)粒DNA。本試劑盒提取到的質(zhì)粒DNA可直接用于后續(xù)酶切、轉(zhuǎn)化和測序等實(shí)驗(yàn)。
組分信息
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類別 |
組分編號(hào) |
組分名稱 |
18538ES50 |
18538ES70 |
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PartⅠ |
18538-A |
RNase A |
125 μL |
500 μL |
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PartⅡ |
18538-B |
磁珠懸浮液 |
1 mL×1支 |
1 mL×4支 |
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18538-C |
Buffer P1 |
12.5 mL |
50 mL |
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18538-D |
Buffer P2 |
12.5 mL |
50 mL |
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18538-E |
Buffer P3 |
12.5 mL |
50 mL |
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18538-F |
Wash Buffer A |
25 mL |
100 mL |
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18538-G |
Wash Buffer B |
12 mL |
50 mL |
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18538-H |
Wash Buffer C |
10 mL |
40 mL |
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18538-I |
洗脫液 |
5 mL |
25 mL |
儲(chǔ)存條件
1.PartⅠ冰袋運(yùn)輸，-25~-15℃ 保存，有效期2年；
2.PartⅡ室溫運(yùn)輸，室溫保存，有效期18個(gè)月。
注意事項(xiàng)
- Buffer P2 和 Buffer P3 中含有刺激性物質(zhì)，操作過程中應(yīng)穿上實(shí)驗(yàn)服，戴好乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮膚或眼睛后，請(qǐng)立即用清水或生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)生的幫助。
- 洗脫時(shí)可能存在磁珠殘留，吸取樣本時(shí)應(yīng)盡量避免吸入磁珠。
- 本產(chǎn)品僅作科研用途！
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
- 自備儀器與試劑：臺(tái)式離心機(jī)、磁力架、金屬浴、小型離心機(jī)、渦旋振蕩儀、核酸提取儀、異丙醇、無水乙醇。
- 首次使用前，將 RNase A (18538-A)全部加入到Buffer P1（18538-C）瓶中，充分混勻后使用，并做好標(biāo)記，儲(chǔ)存于2-8℃。
- 按瓶身標(biāo)簽所示，加入適量的無水乙醇稀釋 Wash Buffer B（18538-G），并在標(biāo)簽的方框中打勾做好“乙醇已加”的標(biāo)記。18538ES50中，Wash Buffer B（18538-G）每瓶需加入48 mL無水乙醇；18538ES70中，Wash Buffer B（18538-G）每瓶需加入200 mL無水乙醇。
- 使用前請(qǐng)檢查Buffer P2和Wash Buffer A是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀，請(qǐng)于37℃水浴重新溶解。
操作方法
- 手動(dòng)單管提取
樣本預(yù)處理：
- 從新鮮培養(yǎng)的平板中挑取一個(gè)單克隆菌落，接種到含對(duì)應(yīng)抗生素的 LB 培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng) 12-16 h。
【注】：細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間不應(yīng)超過 16 h。培養(yǎng)時(shí)間超過 16 h的細(xì)菌開始出現(xiàn)溶解現(xiàn)象，可能導(dǎo)致質(zhì)粒 DNA 的得率降低。
【注】：用于細(xì)菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基所占容器的體積不應(yīng)大于 1/4。
【注】：長時(shí)間儲(chǔ)存的甘油菌中的細(xì)菌可能已經(jīng)出現(xiàn)細(xì)菌個(gè)體間基因型的分化，并混有丟失質(zhì)粒的細(xì)菌。甘油菌必須在含有抗生素的平板上劃線篩選，挑選生長良好的單菌落用于接種培養(yǎng)。
- 取 1-5 mL 過夜培養(yǎng)的菌液，12,000 rpm 離心 1 min，吸棄上清液，收集菌體沉淀。
【注】：菌液較多時(shí)，可通過多次離心將菌體沉淀收集在一個(gè)離心管中。
- 向菌體沉淀中加入 250 µL Buffer P1，吹打或渦旋重懸菌體沉淀。
【注】：確保菌體徹底重懸，否則影響得率和質(zhì)量。
【注】：確保Buffer P1中已添加 RNase A。
- 加入 250 µL Buffer P2，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次以充分裂解菌體。
【注】：使用 Buffer P2 前確認(rèn)溶液中沒有沉淀存在；Buffer P2 使用完后應(yīng)蓋緊瓶蓋，避免與空氣長期接觸。
【注】：裂解時(shí)間與菌量相關(guān)，當(dāng)細(xì)菌裂解充分時(shí)，溶液應(yīng)呈粘稠的透明狀；如果達(dá)不到上述效果，可能是細(xì)菌用量過多所致，可增加
翻轉(zhuǎn)的次數(shù)以達(dá)到粘稠的透明狀,此步驟最長不能超過5 min。
【注】：此步驟不可用旋渦振蕩器混勻，否則將導(dǎo)致最后制備的質(zhì)粒中混有基因組 DNA。
- 加入 250 µL Buffer P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000 rpm 室溫離心 10 min ，小心地吸取 700 μL上清液至新的1.5 mL離心管中。
- 向上述 700 μL上清液中加入300 μL異丙醇和20 µL磁珠懸浮液，振蕩混勻5 min。
【注】：磁珠懸浮液使用前需充分渦旋混勻，保證磁珠徹底重懸，每加樣幾次后需充分搖勻后繼續(xù)加樣。
- 短暫離心，將離心管置于磁力架上，待磁珠吸附完全后，吸棄上清。
- 加入500 µL Wash Buffer A，振蕩混勻2 min，短暫離心，將離心管置于磁力架上，待磁珠吸附完全后，吸棄上清。
- 加入500 µL Wash Buffer B（確保已加入無水乙醇），振蕩混勻1.5 min，短暫離心，將離心管置于磁力架上，待磁珠吸附完全后，吸棄上清。
- 加入500 µL Wash Buffer B（確保已加入無水乙醇），振蕩混勻1 min，短暫離心，將離心管置于磁力架上，待磁珠吸附完全后，吸棄上清。
- 再次離心后，將離心管置于磁力架上靜置，待磁珠完全吸附，盡量吸棄所有液體。
- 將離心管敞口放置5 min，使無水乙醇揮發(fā)干凈。
- 將離心管從磁力架上取下，加入70 μL洗脫液，渦旋混勻。短暫離心，65℃孵育6 min，期間可渦旋混勻以提高洗脫效率。
- 短暫離心后，將離心管置于磁力架上靜置，待磁珠完全吸附，小心吸取上清到新的離心管中，即得到純的質(zhì)粒DNA。注意不要吸到磁珠，否則影響質(zhì)粒純度。
Ver.CN20240731
