Colorimetric Inhibition and produce superoxide anion assay kit抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-）檢測(cè)試劑盒（比色法）
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產(chǎn)品說(shuō)明書
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已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
模擬機(jī)體中黃嘌呤與黃嘌呤氧氣化酶反應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基，加入電子傳遞物質(zhì)及顯色劑，使反應(yīng)體系呈現(xiàn)紫紅色，可利用分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)抗超氧陰離子的物質(zhì)，例如：白細(xì)胞、有些抗腫瘤的藥物，可增加此反應(yīng)，使超氧陰離子自由基增加，故比色時(shí)顏色變深。依據(jù)形成物的顏色深淺計(jì)算出抑制或產(chǎn)生超氧陰離子自由基的能力強(qiáng)弱。當(dāng)被測(cè)樣本中含有超氧陰離子自由基抑制劑時(shí)，則比色時(shí)測(cè)定管的吸光度低于對(duì)照管的吸光度，而如果被測(cè)樣本中含有產(chǎn)生超氧陰離子自由基物質(zhì)時(shí)，則比色時(shí)測(cè)定管的吸光度高于對(duì)照管的吸光度，通過(guò)以維生素C做標(biāo)準(zhǔn)，可計(jì)算出被檢物品對(duì)超氧陰離子自由基的影響能力。
產(chǎn)品組分
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組分編號(hào) |
組分名稱 |
組分規(guī)格 |
儲(chǔ)存條件 |
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60744-A |
試劑一 |
5 mL×1 |
2~8℃，天冷時(shí)或放冰箱會(huì)有部分結(jié)晶析出，需 37℃水浴溶解后再用；用時(shí)按1：9 的比例加ddH2O混合配成試劑一應(yīng)用液，2~8℃保存 |
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60744-B |
試劑二 |
5 mL×1 |
2~8℃ |
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60744-C |
試劑三 |
5 mL×1 |
2~8℃ |
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60744-D |
試劑四 |
350 μL×1 |
-25~-15℃，用時(shí)按試劑四：試劑五=1：14比例配制成試劑四應(yīng)用液，置冰上備用，現(xiàn)配現(xiàn)用 |
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60744-E |
試劑五 |
5 mL×1 |
2~8℃ |
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60744-F |
試劑六 |
1 vial |
2~8℃，粉末，用時(shí)加ddH2O 37.5 mL加熱至 70-80℃溶解，配好后2~8℃避光保存 |
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60744-G |
試劑七 |
1 vial |
2~8℃，粉末，用時(shí)加ddH2O 37.5 mL溶解后備用，配好后的試劑2~8℃避光保存 |
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60744-H |
標(biāo)準(zhǔn)品 |
1 vial×4 |
2~8℃，用時(shí)將一支Vc標(biāo)準(zhǔn)品加ddH2O定容至5 mL（標(biāo)準(zhǔn)品配制后當(dāng)天內(nèi)使用）配成Vc標(biāo)準(zhǔn)貯備液，再取1 mL該貯備液加4 mL ddH2O（5倍稀釋）配成 0.15 mg/mL Vc標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液，現(xiàn)配現(xiàn)用。Vc 標(biāo)準(zhǔn)品配置后見(jiàn)光極易分解，配制好的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液需在30 min內(nèi)檢測(cè) |
儲(chǔ)存條件
2~8℃避光保存，有效期6個(gè)月。部分產(chǎn)品需置于-25~-15℃保存，部分產(chǎn)品需現(xiàn)配現(xiàn)用，部分產(chǎn)品需避光，請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明進(jìn)行。
使用說(shuō)明
- 樣本前處理
- 血清(血漿)樣本：（采血時(shí)必須避免溶血）血清（血漿）直接使用，樣本2~8℃存放最好當(dāng)天檢測(cè)，如來(lái)不及可放0℃以下冷凍保存，溫度越低存放時(shí)間越長(zhǎng)。
- 組織樣本：準(zhǔn)確稱取待測(cè)組織的重量，按重量（g）：體積(mL)=1：9 的比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，制成10%的組織勻漿，2500 rpm，離心10 min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。(取部分上清液測(cè)定蛋白濃度)
- 細(xì)胞樣本：
- 細(xì)胞收集：貼壁胰酶消化或細(xì)胞刮刮下，轉(zhuǎn)移到離心管中1000-2000 rpm，離心5分鐘后棄上清，取沉淀，懸浮細(xì)胞直接離心收集沉淀。
- 細(xì)胞破碎，加 0.5-1 mL的PBS（推薦Cat# 60152）清洗1-2次，同上1000-2000 rpm，離心收集沉淀細(xì)胞，再加入 0.3-0.5 mL 0.1M PH 7.4的等滲PBS緩沖液懸浮細(xì)胞，冰水浴條件下超聲破碎（功率300W，3~5 s/次，間隔30 s,重復(fù)3~5次）或手動(dòng)研磨破碎細(xì)胞，取破碎后的細(xì)胞懸液待測(cè)。
【注】若懸液有明顯顆粒物或絮狀物，可2000 rpm，離心10 min后取上清使用。
- 操作表
表1 加樣方法
|
加樣種類 |
對(duì)照管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
測(cè)定管 |
|
試劑一應(yīng)用液（mL） |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
|
ddH2O（mL） |
0.05 |
/ |
/ |
|
0.15 mg/mL Vc標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液（mL） |
/ |
0.05 |
/ |
|
樣品（mL） |
/ |
/ |
0.05 |
|
試劑二（mL） |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
試劑三（mL） |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
試劑四應(yīng)用液（mL） |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
用旋渦混勻器充分混勻，37℃恒溫水浴40 min |
|||
|
顯色劑（mL）：按照試劑六溶液︰試劑七溶液︰冰乙酸=3 ︰3︰2 的體積比配置，2~8℃避光保存 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
|
混勻，室溫靜置10 min，倒入1 cm光徑比色杯中，ddH2O調(diào)零，波長(zhǎng)550 nm處比色 |
|||
【注】最佳取樣濃度：因反應(yīng)體系中在規(guī)定的底物濃度下，抗各種物質(zhì)抗O2 -能力不一樣，根據(jù)朗伯—比耳定律，樣本濃度不可太大也不可太小，否則影響結(jié)果。因此在正式實(shí)驗(yàn)前必須做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最佳取樣濃度。
- 計(jì)算公式（因各種物質(zhì)不同，則定義及計(jì)算公式也不一樣，具體如下：）
- 血清（血漿）等液體樣本計(jì)算公式
a. 定義：在反應(yīng)系統(tǒng)中，每升血清（血漿）或液體樣本在37℃反應(yīng)40 min所抑制的超氧陰離子自由基相當(dāng)于1 mg的維生素C所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個(gè)活力單位U。
b. 計(jì)算公式：
C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，0.15 mg/mL；1000：?jiǎn)挝粨Q算，mL→L；
- 組織、細(xì)胞計(jì)算公式
a. 定義：在反應(yīng)系統(tǒng)中，每克組織（細(xì)胞）蛋白在37℃反應(yīng)40 min所抑制的超氧陰離子自由基相當(dāng)于1 mg的維生素C所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個(gè)活力單位U。
b. 計(jì)算公式：
C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，0.15 mg/mL；1000：?jiǎn)挝粨Q算，mL→L；Cpr：相應(yīng)組織樣本濃度下的蛋白濃度，prot指蛋白；
- 本品尚可檢測(cè)產(chǎn)生超氧陰離子的改變，例如白細(xì)胞，某些中西藥物等，其計(jì)算公式如下：
a. 定義：在反應(yīng)系統(tǒng)中，每升（克）物質(zhì)在37℃反應(yīng)40 min所產(chǎn)生的超氧陰離子自由基相當(dāng)于1 mg的維生素C所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個(gè)活力單位。
b. 計(jì)算公式一：
計(jì)算公式二：
W：樣本重量（g），V提：提取液的總體積（L）；
注意事項(xiàng)
1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。
2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
3. 因反應(yīng)體系中在規(guī)定的底物濃度下，各種物質(zhì)抗O2 -能力不一樣，取樣濃度不可太大或太小，否則影響結(jié)果。因此在正式實(shí)驗(yàn)前必須做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最佳取樣濃度。預(yù)實(shí)驗(yàn)后再進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)，否則由此導(dǎo)致的后果用戶自行承擔(dān)。
附錄Ⅰ：Vc標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置
1. 前處理：取Vc標(biāo)準(zhǔn)品一支，用ddH2O配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液待測(cè)。
2. 操作表
表2 加樣方法
|
加樣種類 |
對(duì)照管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
|
試劑一應(yīng)用液（mL） |
1.0 |
1.0 |
|
ddH2O（mL） |
0.05 |
/ |
|
0.15 mg/mL Vc標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液（mL） |
/ |
0.05 |
|
試劑二（mL） |
0.1 |
0.1 |
|
試劑三（mL） |
0.1 |
0.1 |
|
試劑四應(yīng)用液（mL） |
0.1 |
0.1 |
|
用旋渦混勻器充分混勻，37℃恒溫水浴40 min |
||
|
顯色劑（mL）：按照試劑六溶液︰試劑七溶液︰冰乙酸=3 ︰3︰2 的體積比配置，2~8℃避光保存 |
2.0 |
2.0 |
|
混勻，室溫靜置10 min，倒入1 cm光徑比色杯中，ddH2O調(diào)零，波長(zhǎng)550 nm處比色 |
||
3. 結(jié)果處理
可選取Vc標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，抑制率（100%）為縱坐標(biāo)作線性圖（標(biāo)準(zhǔn)曲線），也可不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接套用計(jì)算公式計(jì)算即可，結(jié)果無(wú)影響。
附錄Ⅱ：脂血樣本的測(cè)定
1. 操作表
表3 加樣方法
|
加樣種類 |
對(duì)照管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
測(cè)定管 |
測(cè)定空白管 |
|
試劑一應(yīng)用液（mL） |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
|
ddH2O（mL） |
0.05 |
/ |
/ |
/ |
|
0.15 mg/mL Vc標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液（mL） |
/ |
0.05 |
/ |
/ |
|
樣品（mL） |
/ |
/ |
0.05 |
/ |
|
試劑二（mL） |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
試劑三（mL） |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
試劑四應(yīng)用液（mL） |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
用旋渦混勻器充分混勻，37℃恒溫水浴40 min |
|
|||
|
顯色劑（mL）：按照試劑六溶液︰試劑七溶液︰冰乙酸=3 ︰3︰2 的體積比配置，2~8℃避光保存 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
|
樣本（mL） |
/ |
/ |
/ |
0.05 |
|
三氯甲烷（mL） |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
|
混勻，3500 rpm離心10 min，取上清，倒入1 cm光徑比色杯中，ddH2O調(diào)零，波長(zhǎng)550 nm處比色 |
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2. 結(jié)果處理
C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，0.15 mg/mL；1000：?jiǎn)挝粨Q算，mL→L；
【注】1. 一般的含脂類的標(biāo)本都可以按照這個(gè)操作表操作，排除脂類對(duì)測(cè)定的干擾。2. 三氯甲烷需自備，并且對(duì)于一些重度高脂，有可能會(huì)出現(xiàn)加完與樣本等量的氯仿后上清還是渾濁，這時(shí)需要加大氯仿的量，再次混勻離心至上清澄清。
Ver.CN20240827
