Colorimetric Malondialdehyde (MDA) assay kit (TBA) 丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒（TBA法）
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產(chǎn)品簡(jiǎn)介
機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化物。如：醛基（丙二醛MDA）、酮基、羥基、羰基、氫過(guò)氧基或內(nèi)過(guò)氧基，以及新的氧自由基等。脂質(zhì)過(guò)氧化作用不僅把活性氧轉(zhuǎn)化成活性化學(xué)劑，即非自由基性的脂類分解產(chǎn)物，而且通過(guò)鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)，放大活性氧的作用。因此，初始的一個(gè)活性氧能導(dǎo)致很多脂類分解產(chǎn)物的形成，這些分解產(chǎn)物中，一些是無(wú)害的，另一些則能引起細(xì)胞代謝及功能障礙，甚至死亡。氧自由基不但通過(guò)生物膜中多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化引起細(xì)胞損傷，而且還能通過(guò)脂氫過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷。因而測(cè)試MDA的量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。
MDA的測(cè)定常常與SOD的測(cè)定相互配合，SOD活力的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，通過(guò)SOD與MDA的結(jié)果分析有助于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、藥理及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。
本試劑盒是在國(guó)內(nèi)外眾多測(cè)試方法的基礎(chǔ)上改進(jìn)的一種微量、快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、對(duì)操作人員健康無(wú)損害的測(cè)試方法。通過(guò)測(cè)試可反映出血清（血漿）、乳汁等細(xì)胞外液、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞以及各種動(dòng)植物的細(xì)胞水平及亞細(xì)胞水平的脂質(zhì)過(guò)氧化物的量。
過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。因底物為硫代巴比妥酸（Thibabituric Acid TBA）所以此法稱TBA法。
產(chǎn)品組分
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組分編號(hào) |
組分名稱 |
組分規(guī)格 |
儲(chǔ)存條件 |
|
60745-A |
試劑一 |
10 mL×1 |
2~8℃，溫度低時(shí)會(huì)凝固，每次測(cè)試前可37℃加熱來(lái)加速溶解，直至溶液透明方可使用 |
|
60745-B |
試劑二 |
6 mL×1 |
2~8℃，用時(shí)每瓶加170 mL蒸餾水混勻（2~8℃保存） |
|
60745-C |
試劑三 |
1 vial |
2~8℃，粉末，用時(shí)加蒸餾水30 mL（加熱到90℃-100℃充分溶解后用蒸餾水補(bǔ)足至30 mL），再加冰醋酸30 mL（2~8℃保存） |
|
60745-D |
標(biāo)準(zhǔn)品 |
5 mL×1 |
2~8℃，液體（濃度：10 nmol/mL） |
儲(chǔ)存條件
2~8℃避光保存，有效期1年。
使用說(shuō)明
一. 規(guī)范操作方法
- 操作表：（操作前請(qǐng)仔細(xì)閱讀下面的“參考取樣濃度（量）”）
表1 加樣方法
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加樣種類 |
空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
測(cè)定管 |
對(duì)照管 |
|
標(biāo)準(zhǔn)品（mL） |
/ |
0.1 |
/ |
/ |
|
無(wú)水乙醇（mL） |
0.1 |
/ |
/ |
/ |
|
測(cè)試樣品（mL） |
/ |
/ |
0.1 |
0.1 |
|
試劑一（mL） |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
試劑二（mL） |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
|
試劑三（mL） |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
/ |
|
50%冰醋酸（mL） |
/ |
/ |
/ |
1.0 |
a. 離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，渦旋混勻器混勻，95℃水浴（或用鍋開蓋煮沸）40 min，取出后流水冷卻，然后3500-4000 rpm，離心10 min，（3000 rpm以下離心時(shí)間需延長(zhǎng)，目的使沉淀完全。另外如有大量脂質(zhì)存在，可加入0.1 mL氯仿，渦旋抽提約60 s后再離心）。取上清，倒入1 cm光徑比色杯中，蒸餾水調(diào)零，波長(zhǎng)532 nm處，測(cè)各管吸光度OD值（吸取上清比色時(shí)不要吸到底部沉淀，用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm處讀數(shù)）。
b. 一般情況下，標(biāo)準(zhǔn)管、空白管每批只需做1-2只，若樣本沒有特殊顏色、濁度等現(xiàn)象，則對(duì)照管可以不測(cè)，用空白管來(lái)代替對(duì)照管。
- 參考取樣濃度（量）：除水生動(dòng)物類的樣本需要提前摸索取樣濃度外，其它動(dòng)物的血清一般直接取樣0.1 mL測(cè)定（甚至樣本量足夠時(shí)可取0.2 mL或0.3 mL），組織勻漿一般取10%的濃度測(cè)定（肝臟樣本稍高些，可直接取0.1 mL，其它組織樣本量足夠時(shí)可取0.2 mL或0.3 mL），細(xì)胞勻漿或細(xì)胞培養(yǎng)液可取樣0.3-0.5 mL測(cè)定（細(xì)胞建議數(shù)量＞106）。取樣量加大時(shí)空白管無(wú)水乙醇、標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)品量、試劑一量也要相應(yīng)加大，其它試劑量不變。
- 標(biāo)準(zhǔn)管參考吸光度：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品取樣量為0.1 mL時(shí)，則分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去空白管的吸光度為0.065-0.070（酶標(biāo)儀測(cè)定取200 μL讀數(shù)時(shí)為0.04左右）。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品取樣量為0.2 mL時(shí)，則標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去空白管的吸光度為0.130-0.140（酶標(biāo)儀測(cè)定取200 μL讀數(shù)時(shí)為0.08左右）。
- 規(guī)范操作方法及簡(jiǎn)便操作方法中，若發(fā)現(xiàn)檢測(cè)樣本吸光度太低，可以將水浴時(shí)間40 min延長(zhǎng)至80 min，但相關(guān)的MDA的檢測(cè)都必須延長(zhǎng)至80 min，以免造成批間差異。
- 結(jié)果計(jì)算
- 血清（血漿）中MDA含量計(jì)算公式：
- 組織中MDA含量計(jì)算公式：
【注】prot指蛋白，nmol/mgprot：納摩爾/毫克蛋白；
二. 簡(jiǎn)便操作方法：（如果樣本數(shù)量很多，可以采用簡(jiǎn)便操作方法）
1. 混合試劑的配制：
工作液Ⅰ的配制：試劑一：試劑二：試劑三=0.1：3：1，現(xiàn)配現(xiàn)用；
工作液Ⅱ的配制：試劑一：試劑二：50%冰醋酸= 0.1：3：1，現(xiàn)配現(xiàn)用。
2. 簡(jiǎn)便操作表：
表2 加樣方法
|
加樣種類 |
空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
測(cè)定管 |
對(duì)照管 |
|
標(biāo)準(zhǔn)品（mL） |
/ |
0.1 |
/ |
/ |
|
無(wú)水乙醇（mL） |
0.1 |
/ |
/ |
/ |
|
測(cè)試樣品（mL） |
/ |
/ |
0.1 |
0.1 |
|
工作液Ⅰ（mL） |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
/ |
|
工作液Ⅱ（mL） |
/ |
/ |
/ |
4.0 |
a. 離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，渦旋混勻器混勻，95℃水?。ɑ蛴缅侀_蓋煮沸）40 min，取出后流水冷卻，然后3500-4000 rpm，離心10 min。（3000 rpm以下離心時(shí)間需延長(zhǎng)，目的使沉淀完全。）取上清，倒入1 cm光徑比色杯中，蒸餾水調(diào)零，波長(zhǎng)532 nm處，測(cè)各管吸光度OD值（吸取上清比色時(shí)不要吸到底部沉淀，用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm處讀數(shù)）。
b. 若樣本沒有特殊顏色、濁度等現(xiàn)象，則對(duì)照管可以不測(cè)，用空白管來(lái)代替對(duì)照管。
3. 樣本加入量可根據(jù)含量高低來(lái)調(diào)整，參考上述取樣濃度（量）。
4. 以上規(guī)范操作法及簡(jiǎn)便操作法適用于人及各種動(dòng)植物的樣本（包括血清、動(dòng)植物組織及體液、細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液等）。
5. 規(guī)范操作方法及簡(jiǎn)便操作方法中，若發(fā)現(xiàn)檢測(cè)樣本吸光度太低，可以將水浴時(shí)間40 min延長(zhǎng)至80 min，但相關(guān)的MDA的檢測(cè)都必須延長(zhǎng)至80 min，以免造成批間差異。
- 結(jié)果計(jì)算
- 血清（血漿）中MDA含量計(jì)算公式：
- 組織中MDA含量計(jì)算公式：
【注】prot指蛋白，nmol/mgprot：納摩爾/毫克蛋白；
三. 微量操作方法：（對(duì)于MDA含量很低或樣本量少的樣本可用微量操作方法，例如小鼠（兒）血清（血漿）、小鼠肺組織、皮膚組織、腎組織、視網(wǎng)膜、細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液等）
1. 樣本前處理見實(shí)驗(yàn)方法學(xué)中的組織勻漿處理，可制成10%或5%的勻漿，但要注意，因樣本量很少，所以做好的組織勻漿最好不要離心，例如培養(yǎng)的細(xì)胞等破碎后可以不離心。取樣時(shí)注意要搖勻后立即取樣。
2. 試劑組成與配制
微量操作法中的試劑三配制如下：
按規(guī)范操作方法來(lái)配制MDA 3號(hào)試劑：將1支MDA 3號(hào)粉末（試劑三）倒入燒杯內(nèi)加90℃-100℃的熱蒸餾水32 mL充分溶解（溶解過(guò)程中可適當(dāng)加熱助溶，因蒸餾水熱脹冷縮的性質(zhì)，加熱過(guò)程會(huì)蒸發(fā)，本應(yīng)加30 mL，現(xiàn)多加2 mL，冷卻后在30 mL）。隨后再加入30 mL冰醋酸混勻即可配成。
再將上述配好MDA 3號(hào)試劑用50%冰醋酸按2:1進(jìn)行稀釋（按需配置），混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。配好的試劑置于4℃避光保存。
【注】50%冰醋酸的配制：50 mL蒸餾水加50 mL冰醋酸混合而成。
3. 操作步驟：
表3 加樣方法
|
加樣種類 |
空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
測(cè)定管 |
對(duì)照管 |
|
標(biāo)準(zhǔn)品（mL） |
/ |
0.1 |
/ |
/ |
|
無(wú)水乙醇（mL） |
0.1 |
/ |
/ |
/ |
|
測(cè)試樣品（mL） |
/ |
/ |
0.1 |
0.1 |
|
試劑一（mL） |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
搖晃離心管架，混勻 |
||||
|
試劑二（mL） |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
|
試劑三（mL） |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
/ |
|
50%冰醋酸（mL） |
/ |
/ |
/ |
1.5 |
a. 離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，渦旋混勻器混勻，95℃水?。ɑ蛴缅侀_蓋煮沸）40 min，取出后流水冷卻，然后3500-4000 rpm，離心10 min。（3000 rpm以下離心時(shí)間需延長(zhǎng)，目的使沉淀完全。）取上清，倒入1 cm光徑比色杯中，蒸餾水調(diào)零，波長(zhǎng)532 nm處，測(cè)各管吸光度OD值（吸取上清比色時(shí)不要吸到底部沉淀，用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm處讀數(shù)）。
【注】（含量較低的樣本）在樣本量足夠時(shí)，可增加取樣量至0.2 mL（同時(shí)無(wú)水乙醇、標(biāo)準(zhǔn)品、試劑一量均加0.2 mL，其它試劑量不變）。
b. 一般情況下，標(biāo)準(zhǔn)管、空白管每批只需做1-2只，若樣本沒有特殊顏色、濁度等現(xiàn)象，則對(duì)照管可以不測(cè)，用空白管來(lái)代替對(duì)照管。
4. 用此方法所測(cè)各管吸光度值比規(guī)范操作方法要高，但不影響最終結(jié)果。
5. 若發(fā)現(xiàn)檢測(cè)樣本吸光度太低，可以將水浴時(shí)間40 min延長(zhǎng)至80 min，但相關(guān)的MDA的檢測(cè)都必須延長(zhǎng)至80 min，以免造成批間差異。
6. 此方法標(biāo)準(zhǔn)管參考吸光度：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品取樣量為0.1 mL時(shí)，則標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去空白管吸光度為0.103-0.112。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品取樣量為0.2 mL時(shí)，則標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去空白管吸光度為0.206-0.224。
- 結(jié)果計(jì)算
- 血清（血漿）中MDA含量計(jì)算公式：
- 組織中MDA含量計(jì)算公式：
【注】prot指蛋白，nmol/mgprot：納摩爾/毫克蛋白；
四. 高脂血癥、油脂樣本中的MDA測(cè)定操作方法：（例如檢測(cè)豆油或色拉油、菜油中的MDA含量）
1. 操作方法
表4 加樣方法
|
加樣種類 |
空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
測(cè)定管 |
|
標(biāo)準(zhǔn)品（mL） |
/ |
0.1 |
/ |
|
無(wú)水乙醇（mL） |
0.1 |
/ |
/ |
|
油脂類樣品或高脂血清（血漿）(mL) |
/ |
/ |
0.1 |
|
試劑一（mL） |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
搖晃離心管架，混勻 |
|||
|
試劑二（mL） |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
|
試劑三（mL） |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
|
離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，渦旋混勻器混勻，95℃水?。ɑ蛴缅侀_蓋煮沸）80 min，取出后流水冷卻 |
|||
|
氯仿（mL） |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
渦旋震蕩1-3 min，3500-4000 rpm，離心10 min。取上清，倒入1 cm光徑比色杯中，蒸餾水調(diào)零，波長(zhǎng)532 nm處，測(cè)各管吸光度OD值（吸取上清比色時(shí)不要吸到底部沉淀和氯仿，用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm處讀數(shù)） |
|||
a. 一般情況下，標(biāo)準(zhǔn)管、空白管每批只需做1-2只。
b. 油脂類樣本一般要用無(wú)水乙醇稀釋2-3倍后取樣測(cè)定。某些高脂血清（血漿）需要用生理鹽水稀釋2倍后測(cè)定。
2. 標(biāo)準(zhǔn)管參考吸光度：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品取樣量為0.1 mL時(shí)，則分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去空白管的吸光度為0.065-0.070（酶標(biāo)儀測(cè)定取200 μL讀數(shù)時(shí)為0.04左右）。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品取樣量為0.2 mL時(shí)，則標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去空白管的吸光度為0.130-0.140（酶標(biāo)儀測(cè)定取200 μL讀數(shù)時(shí)為0.1左右）。
3. 結(jié)果計(jì)算
高脂血、油中MDA含量計(jì)算公式：
五. 紅細(xì)胞中的MDA測(cè)定操作方法
（一）微量紅細(xì)胞中的MDA檢測(cè)方法（樣本量少時(shí)用）
1. 樣本前處理：（可用以下二種方法中的一種）
- 載玻片取全血，進(jìn)行MDA測(cè)定：
如果您所需測(cè)的血樣很少又很珍貴，例如新生兒指血，或小老鼠的尾血，可采用載玻片上滴加1-2滴肝素涂勻，60ºC以下烤干，或自然吹干。將以上采取的少量血樣滴在有肝素的載玻片上，用微量加樣器取您所需的血量，再制備成1︰99的溶血液。（即全血：蒸餾水=1︰99）。
- 玻璃微量采血管采集紅細(xì)胞及溶血液的制備：
a. 用20 μL的玻璃微量采血管取載玻片上的肝素抗凝全血20 μL左右。將玻璃毛細(xì)采血管置水平位，迅速取下吸球，將空隙長(zhǎng)的一端放在酒精燈火焰的三分之一處燒至透紅，管端變成圓球狀閉結(jié)為止。用尺測(cè)量并記錄血柱長(zhǎng)度a厘米。用紙將采血管卷好，然后將采血管封閉端朝下裝入離心管中，1500 rpm，離心5-10 min，取出后用小砂輪在血清與紅細(xì)胞分界處劃開掰斷（或用剪刀直接剪斷）。將有紅細(xì)胞的開口端倒放入裝有1 mL蒸餾水的離心管中，再以1500 rpm，離心5 min，此時(shí)毛細(xì)管中的紅細(xì)胞沉淀于離心管底部，用鑷子從離心管中取出毛細(xì)管丟棄后，將離心管放在混勻器上渦旋混勻制成溶血液。
b. 血液稀釋倍數(shù)的計(jì)算：
2. MDA檢測(cè)操作步驟
2.1 方法一：（規(guī)范操作方法）
表5 加樣方法
|
加樣種類 |
空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
測(cè)定管 |
對(duì)照管 |
|
標(biāo)準(zhǔn)品（mL） |
/ |
0.1 |
/ |
/ |
|
無(wú)水乙醇（mL） |
0.1 |
/ |
/ |
/ |
|
1:x 血球溶血液（mL） |
/ |
/ |
0.1 |
0.1 |
|
試劑一（mL） |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
搖晃離心管架，混勻 |
||||
|
試劑二（mL） |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
|
試劑三（mL） |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
|
50%冰醋酸（mL） |
/ |
/ |
/ |
1.0 |
a. 離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，渦旋混勻器混勻，95℃水?。ɑ蛴缅侀_蓋煮沸）40 min，取出后流水冷卻，然后3500-4000 rpm，離心10 min。（3000 rpm以下離心時(shí)間需延長(zhǎng)，目的使沉淀完全。）取上清，倒入1 cm光徑比色杯中，蒸餾水調(diào)零，波長(zhǎng)532 nm處，測(cè)各管吸光度OD值（吸取上清比色時(shí)不要吸到底部沉淀，用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm處讀數(shù)）。
b. 一般情況下，標(biāo)準(zhǔn)管、空白管每批只需做1-2只，若樣本沒有特殊顏色、濁度等現(xiàn)象，則對(duì)照管可以不測(cè)，用空白管來(lái)代替對(duì)照管。
c. 若發(fā)現(xiàn)檢測(cè)樣本吸光度太低，可以將水浴時(shí)間40 min延長(zhǎng)至80 min，但相關(guān)的MDA的檢測(cè)都必須延長(zhǎng)至80 min，以免造成批間差異。
d. 規(guī)范操作方法標(biāo)準(zhǔn)管參考吸光度：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品取樣量為0.1 mL時(shí)，則分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去空白管的吸光度為0.065-0.070（酶標(biāo)儀測(cè)定取200 μL讀數(shù)時(shí)為0.04左右）。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品取樣量為0.2 mL時(shí)，則標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去空白管的吸光度為0.130-0.140（酶標(biāo)儀測(cè)定取200 μL讀數(shù)時(shí)為0.1左右）。
2.2 方法二：（微量法）
表6 加樣方法
|
加樣種類 |
空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
測(cè)定管 |
對(duì)照管 |
|
標(biāo)準(zhǔn)品（mL） |
/ |
0.1 |
/ |
/ |
|
無(wú)水乙醇（mL） |
0.1 |
/ |
/ |
/ |
|
測(cè)試樣品（mL） |
/ |
/ |
0.1 |
0.1 |
|
試劑一（mL） |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
搖晃離心管架，混勻 |
||||
|
試劑二（mL） |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
|
試劑三（mL） |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
/ |
|
50%冰醋酸（mL） |
/ |
/ |
/ |
1.5 |
a. 離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，渦旋混勻器混勻，95℃水?。ɑ蛴缅侀_蓋煮沸）40 min，取出后流水冷卻，然后3500-4000 rpm，離心10 min。（3000 rpm以下離心時(shí)間需延長(zhǎng)，目的使沉淀完全。）取上清，倒入1 cm光徑比色杯中，蒸餾水調(diào)零，波長(zhǎng)532 nm處，測(cè)各管吸光度OD值（吸取上清比色時(shí)不要吸到底部沉淀，用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm處讀數(shù)）。
b. 一般情況下，標(biāo)準(zhǔn)管、空白管每批只需做1-2只，若樣本沒有特殊顏色、濁度等現(xiàn)象，則對(duì)照管可以不測(cè)，用空白管來(lái)代替對(duì)照管。
c. 用此方法所測(cè)各管吸光度值比規(guī)范操作方法要高，但不影響最終結(jié)果。
d. 若發(fā)現(xiàn)檢測(cè)樣本吸光度太低，可以將水浴時(shí)間40 min延長(zhǎng)至80 min，但相關(guān)的MDA的檢測(cè)都必須延長(zhǎng)至80 min，以免造成批間差異。
e. 此方法標(biāo)準(zhǔn)管參考吸光度：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品取樣量為0.1 mL時(shí)，則標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去空白管吸光度為0.103-0.112。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品取樣量為0.2 mL時(shí)，則標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去空白管吸光度為0.206-0.224。
【注】將上述配好MDA 3號(hào)試劑用50%冰醋酸按2:1進(jìn)行稀釋（按需配置），混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。配好的試劑置于4℃避光保存。
【注】50%冰醋酸的配制：50 mL蒸餾水加50 mL冰醋酸混合而成。
3. 紅細(xì)胞中MDA的計(jì)算：
【注】nmol/mgHb：納摩爾/毫克血紅蛋白；
（二）全血中紅細(xì)胞MDA檢測(cè)方法（樣本量多時(shí)用）
1. 樣本前處理：
① 血球制備：取肝素抗凝全血0.15 mL，加2-3 mL的生理鹽水，2500-3000 rpm，離心5-10 min（小鼠紅細(xì)胞容易破裂，最好用1000-1500 rpm，離心5-10 min），棄上清留沉淀的紅細(xì)胞。上清一定要盡量吸凈丟棄，以免影響結(jié)果。
② 溶血液的制備：取離心后沉淀的紅細(xì)胞加所取全血體積4倍的蒸餾水（0.6 mL）,在渦旋混勻器上混勻1 min使細(xì)胞充分
溶解。
③ 抽提：在上述溶血液中加全血體積2倍的無(wú)水乙醇（0.3 mL），也可用95%乙醇代替在渦旋混勻器上充分混勻30 s。
④ 沉淀蛋白：再加全血體積2倍的氯仿（0.3 mL）置渦旋混勻器上混勻1 min，然后3000～3500 rpm，離心5-10 min。此時(shí)液體分為三層，上層為MDA抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷。取上清并記錄體積，約0.9 mL。
2. 操作步驟：
① 1 nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的配制：將標(biāo)準(zhǔn)品（10 nmol/mL）進(jìn)行10倍稀釋，即標(biāo)準(zhǔn)品1 mL加9 mL的無(wú)水乙醇配成 1 nmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。
② 若發(fā)現(xiàn)檢測(cè)樣本吸光度太低，可以將水浴時(shí)間40 min延長(zhǎng)至80 min，但相關(guān)的MDA的檢測(cè)都必須延長(zhǎng)至80 min，以免造成批間差異。
表7 加樣方法
|
加樣種類 |
空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
測(cè)定管 |
|
標(biāo)準(zhǔn)品（1 nmol/mL）（mL） |
/ |
0.8 |
/ |
|
無(wú)水乙醇（mL） |
0.8 |
/ |
/ |
|
抽提液（mL） |
/ |
/ |
0.8 |
|
試劑二（mL） |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
|
試劑三（mL） |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
a. 離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，渦旋混勻器混勻，95℃水浴（或用鍋開蓋煮沸）40 min，取出后流水冷卻，然后3500-4000 rpm，離心10 min。（3000 rpm以下離心時(shí)間需延長(zhǎng)，目的使沉淀完全。）取上清，倒入1 cm光徑比色杯中，蒸餾水調(diào)零，波長(zhǎng)532 nm處，測(cè)各管吸光度OD值（吸取上清比色時(shí)不要吸到底部沉淀，用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm處讀數(shù)）。
b. 計(jì)算公式：
全血中MDA含量計(jì)算公式：
注意事項(xiàng)
1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。
2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
3. 離心管要潔凈，尤其測(cè)微量樣品時(shí)更為重要。
4. 配制試劑時(shí)要充分混勻。測(cè)試過(guò)程中第一管吸的試劑要丟棄，加樣品或試劑時(shí)要垂直加，不要加在管壁上。95℃水浴前要充分混勻。
5. 溫度低時(shí)試劑一會(huì)凝固，一定要水浴加熱至溶液透明方可使用。
6. 水浴時(shí)間及溫度要固定。沒有水浴鍋的可用鋁鍋、鋁盒、鋁盆等開蓋煮沸即可。
7. 離心沉淀一定要充分，否則影響吸光度，造成結(jié)果不穩(wěn)定。這種情況可增加離心轉(zhuǎn)速（＞3000 rpm）或者延長(zhǎng)離心時(shí)間使沉淀完全。
8. 比色時(shí)注意不要將沉淀倒入比色杯中，最好用移液器吸入比色皿。
9. 冬天若發(fā)現(xiàn)測(cè)試溶液呈霧狀可以輕輕放水浴鍋稍稍加熱，待溶液溶解呈透明狀態(tài)用移液器吸取放入比色杯中，若仍然呈霧狀，則考慮為高脂血癥。
10. 樣本取樣量：若您的樣量較多，取樣量可以加倍，無(wú)水乙醇、標(biāo)準(zhǔn)品、試劑一均要加倍，其它試劑量不變。若您的樣本為貧血病人的血樣，則取樣量也要加倍，無(wú)水乙醇、標(biāo)準(zhǔn)品、試劑一的量也要加倍，其它試劑量不變。
11. 洗滌紅細(xì)胞時(shí)，離心后的上清要盡量吸取干凈，以保證抽提液體積準(zhǔn)確。
12. 95℃水浴時(shí)最好用帶蓋的離心管，以免反應(yīng)液的蒸發(fā)。若沒有帶蓋的離心管可用冰箱保鮮膜蓋好，用橡皮筋扎好后在保鮮膜上用針刺一小孔即可代替蓋子。
Ver.CN20240830
