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產(chǎn)品簡(jiǎn)介
谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶。它特異的催化還原型谷胱甘肽(GSH)對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng),可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。GSH-PX的活性中心是硒半胱氨酸,硒是GSH-PX的必需部分,每克分子酶含4克原子硒。測(cè)定GSH-PX的活力可以作為衡量機(jī)體硒水平的一項(xiàng)生化指標(biāo)。
谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)可以促進(jìn)過(guò)氧化氫(H2O2)與還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)生成H2O及氧化型谷胱甘肽(GSSG),谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力可用其酶促反應(yīng)的速度來(lái)表示,測(cè)定此酶促反應(yīng)中還原型谷胱甘肽的消耗,則可求出酶的活力。反應(yīng)方程式為:,GSH-PX的活力以催化GSH的反應(yīng)速度來(lái)表示,由于這二個(gè)底物在沒(méi)有酶的條件下,也能進(jìn)行氧化還原反應(yīng)(稱非酶促反應(yīng)),所以最后計(jì)算此酶活力時(shí)必須扣除非酶促反應(yīng)所引起的GSH減少的部分。
GSH量的測(cè)定:GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸陰離子呈現(xiàn)較穩(wěn)定的黃色,在412 nm處測(cè)其吸光度即可計(jì)算出GSH的量。
產(chǎn)品組分
組分編號(hào) |
組分名稱 |
組分規(guī)格 |
儲(chǔ)存條件 |
60746-A |
試劑一 |
1 mL×1 |
2~8℃,用時(shí)按照100倍比例稀釋配成試劑一應(yīng)用液,現(xiàn)用現(xiàn)配(如取0.1 mL加蒸餾水至10 mL,按需配置即可) |
60746-B |
試劑二 |
1 vial |
2~8℃,粉末,每瓶試劑二加蒸餾水85 -88 mL,高溫加熱至完全溶解,然后再與1瓶試劑三混合,配置成試劑二應(yīng)用液 |
60746-C |
試劑三 |
25 mL×1 |
2~8℃ |
60746-D |
試劑四 |
1 vial |
2~8℃,每瓶加蒸餾水100 mL溶解;溶解時(shí),可置于37℃環(huán)境中加速溶解(如有需要,不是必須) |
60746-E |
顯色劑 |
25 mL×1 |
2~8℃,避光 |
60746-F |
試劑六 |
1 vial×2 |
2~8℃,避光;試劑六應(yīng)用液:每瓶加蒸餾水10 mL溶解,溶解后置于2~8℃避光,可保存五天 |
60746-G |
試劑七 |
5 mL×1 |
2~8℃,試劑七應(yīng)用液(標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液)配制:用時(shí)按照試劑七∶蒸餾水=1∶9的比例進(jìn)行稀釋配置 |
60746-H |
GSH標(biāo)準(zhǔn)品 |
1 vial×2 |
2~8℃ |
【注】試劑二應(yīng)用液配置時(shí):試劑二粉末溶解時(shí)不要用水浴鍋加熱,不要用隔水加熱的方式(因受熱較慢導(dǎo)致溶解困難),最好用能直接加熱的設(shè)備( 如電爐、酒精燈之類的) 加熱,且加熱時(shí)不斷攪拌;試劑二應(yīng)用液配好后為過(guò)飽和溶液,室溫靜置冷卻后,如有結(jié)晶,則取上清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)即可。
儲(chǔ)存條件
2~8℃避光保存,有效期6個(gè)月。
使用說(shuō)明
一. 血清(血漿)中 GSH-PX 活力的測(cè)定
1. 操作方法
表1 加樣方法
加樣種類 |
非酶管 |
酶管 |
1 mmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液(mL) |
0.2 |
0.2 |
待測(cè)血清(血漿)(mL) |
/ |
0.1 |
37℃預(yù)溫5分鐘 |
||
試劑一應(yīng)用液(mL) |
0.1 |
0.1 |
37℃準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘 |
||
試劑二應(yīng)用液(mL) |
2 |
2 |
待測(cè)血清(血漿)(mL) |
0.1 |
/ |
混勻,3500-4000 rpm,離心10 min,取上清1 mL作顯色反應(yīng) |
【注】1 mmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液配制:測(cè)定前取1瓶GSH標(biāo)準(zhǔn)品粉末(60746-H)加到10 mL試劑七應(yīng)用液(標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液)中,充分溶解配成1 mmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液,配好后可置于2~8℃保存1-2周。
表2 加樣方法
加樣種類 |
空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
非酶管 |
酶管 |
標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液(mL) |
1.0 |
/ |
/ |
/ |
20 μmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液(mL) |
/ |
1.0 |
/ |
/ |
上清液(mL) |
/ |
/ |
1.0 |
1.0 |
試劑四應(yīng)用液(mL) |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
顯色劑應(yīng)用液(mL) |
0.25 |
0.25 |
0.25 |
0.25 |
試劑六應(yīng)用液(mL) |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
混勻,室溫靜置15 min后,倒入1 cm光徑比色杯中,蒸餾水調(diào)零,波長(zhǎng)412 nm處,測(cè)各管OD值 |
【注】20 μmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液配制:取1 mmol/L GSH溶液0.2 mL加標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液定容至10 mL充分混勻配成,現(xiàn)用現(xiàn)配。
【注】正式實(shí)驗(yàn)前,請(qǐng)先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),預(yù)實(shí)驗(yàn)后再進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)。
2. 血清中GSH-PX酶活力的計(jì)算
a. 定義:每毫升血清在37℃每分鐘,扣除非酶促反應(yīng)作用,使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個(gè)酶活力單位(U)。
b. 計(jì)算公式:(液體類的樣本均可按此公式計(jì)算)
C標(biāo)準(zhǔn):顯色反應(yīng)中的GSH標(biāo)準(zhǔn)液濃度,20 μmol/L;
N:酶促反應(yīng)體系稀釋倍數(shù),6(2.4 mL/0.4 mL,固定值);
T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;
V樣:樣本取樣量,0.1 mL;
N樣:樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。
3. 血清(血漿)的最佳取樣濃度摸索舉例
a. 樣本來(lái)源:正常組大鼠眼眶取全血,肝素抗凝取血漿。
b. 樣本前處理:用生理鹽水將血漿按1︰1、1︰4、1︰7、1︰9、1︰14、1︰19稀釋成一系列不同濃度的血漿,分別取不同濃度血漿 0.1 mL 按血清(血漿)的操作表進(jìn)行檢測(cè)。
c. 測(cè)定結(jié)果:通過(guò)公式:,選取抑制率在45%-55%之間的,作為最佳取樣濃度。
二. 組織、細(xì)胞、線粒體中GSH-PX活力的測(cè)定
1. 樣本前處理
1)準(zhǔn)確稱取待測(cè)動(dòng)物組織的重量,按重量(g):體積(mL)=1:9 的比例,加入9倍體積的生理鹽水,低溫(0-4℃)條件勻漿,3500 rpm,離心10 min,取上清液待測(cè),制備好的勻漿上清液需要測(cè)定其蛋白濃度。
2)線粒體制備及前處理:取10%的組織勻漿5-10 mL,以1000-2000 rpm,離心10 min(普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī)),取上清液以8000-10000 rpm(低溫高速離心機(jī))離心15 min,沉淀物為線粒體(若不立即測(cè)定,可直接放-20℃或-80℃冰箱保存,3個(gè)月內(nèi)可用)。往線粒體中加入0.2-0.3 mL的勻漿介質(zhì)(推薦0.1 mol/L pH 7-7.4的PBS或生理鹽水),冰水浴條件下超聲破碎(功率:300W,3-5秒/次,間隔30秒,重復(fù)3-5次),制備好的勻漿液若比較均勻可不離心直接測(cè)定。也可采用裂解液裂解(推薦Triton X-100,1-2%濃度,0.1 mL,裂解30-40 min),裂解好的液體可不離心直接測(cè)定,制備好的勻漿液需要測(cè)定其蛋白濃度。
3)細(xì)胞樣本前處理:(貼壁細(xì)胞)用細(xì)胞刮配合等滲PBS刮下或用胰酶消化下來(lái)(消化后加入0.5-1 mL等滲PBS沖洗),再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到另一離心管中,1000 rpm,離心10 min,棄上清液,留細(xì)胞沉淀;用等滲緩沖液清洗1-2次,同樣1000 rpm,離心10 min,棄上清液,留細(xì)胞沉淀(若不立即測(cè)定,可直接放-20℃或-80℃冰箱保存,3個(gè)月內(nèi)可用);往細(xì)胞沉淀中加入0.2-0.3 mL的勻漿介質(zhì)(推薦0.1 mol/L pH 7-7.4的PBS或生理鹽水)(加完勻漿介質(zhì)后輕輕混勻細(xì)胞溶液,使其均勻,吸取少量進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);若是破碎后可以測(cè)蛋白,則不用細(xì)胞計(jì)數(shù)),冰水浴條件下超聲破碎(功率:300W,3-5秒/次,間隔30秒,重復(fù)3-5次)或手動(dòng)勻漿,制備好的勻漿液若比較均勻可不離心直接測(cè)定。也可采用裂解液裂解(推薦Triton X-100,1-2%濃度,0.1 mL,裂解30-40 min),裂解好的液體可不離心直接測(cè)定?!咀ⅰ浚航ㄗh細(xì)胞數(shù)在100萬(wàn)個(gè)以上(細(xì)胞越多,測(cè)定效果越好)。破碎好的液體可顯微鏡觀察細(xì)胞是否破碎完全。
2. 操作方法
1)酶促反應(yīng):(試劑一應(yīng)用液提前5 min在37℃預(yù)溫)
表3 加樣方法
加樣種類 |
非酶管 |
酶管 |
1 mmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液(mL) |
0.2 |
0.2 |
待測(cè)血漿(mL) |
/ |
0.2 |
37℃預(yù)溫5分鐘 |
||
試劑一應(yīng)用液(mL) |
0.1 |
0.1 |
37℃準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘 |
||
試劑二應(yīng)用液(mL) |
2 |
2 |
待測(cè)勻漿(mL) |
0.2 |
/ |
混勻,3500-4000 rpm,離心10 min,取上清1 mL作顯色反應(yīng) |
【注】1 mmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液配制:測(cè)定前取1瓶GSH標(biāo)準(zhǔn)品粉末(60746-H)加到10 mL試劑七應(yīng)用液(標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液)中,充分溶解配成1 mmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液,配好后可置于2~8℃保存1-2周。
【注】正式實(shí)驗(yàn)前,請(qǐng)先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),預(yù)實(shí)驗(yàn)后再進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)。
2)顯色反應(yīng)
表4 加樣方法
加樣種類 |
空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
非酶管 |
酶管 |
標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液(mL) |
1.0 |
/ |
/ |
/ |
20 μmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液(mL) |
/ |
1.0 |
/ |
/ |
上清液(mL) |
/ |
/ |
1.0 |
1.0 |
試劑四應(yīng)用液(mL) |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
顯色劑應(yīng)用液(mL) |
0.25 |
0.25 |
0.25 |
0.25 |
試劑六應(yīng)用液(mL) |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
混勻,室溫靜置15 min后,倒入1 cm光徑比色杯中,蒸餾水調(diào)零,波長(zhǎng)412 nm處,測(cè)各管OD值 |
【注】20 μmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液配制:取 1 mmol/L GSH溶液0.2 mL加標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液定容至10 mL充分混勻配成,現(xiàn)用現(xiàn)配。
3. 組織中GSH-PX酶活力的計(jì)算
a. 定義:每毫克蛋白質(zhì)在37℃每分鐘,扣除非酶促反應(yīng)作用,使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個(gè)酶活力單位(U)。
【注】組織蛋白的測(cè)定:參照實(shí)驗(yàn)方法學(xué)中的考馬斯亮蘭法、BCA法、紫外法及磺基水楊酸法測(cè)出所取樣本中的蛋白毫克數(shù)。
b. 計(jì)算公式:
C標(biāo)準(zhǔn):顯色反應(yīng)中的GSH標(biāo)準(zhǔn)液濃度,20 μmol/L;
N:酶促反應(yīng)體系稀釋倍數(shù),5(2.5 mL/0.5 mL,固定值);
T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;
V樣:樣本取樣量,0.2 mL;
Cpr:勻漿液蛋白濃度,mgprot/mL(prot 指蛋白);
【注】:酶促反應(yīng)體系如有改變,計(jì)算時(shí)實(shí)際的V樣需乘以體系改變的系數(shù)(如酶促反應(yīng)體系縮小2倍后,取樣0.1 mL,計(jì)算時(shí)V樣應(yīng)為0.1 mL×2=0.2 mL)。
3. 組織(勻漿)的最佳取樣濃度摸索舉例
a. 樣本來(lái)源:正常小鼠肝組織,加生理鹽水制備成10%的肝勻漿上清待測(cè)。
b. 樣本前處理:用生理鹽水將10%肝勻漿稀釋成0.5%、0.4%、0.3%、0.25%、0.2%、0.1%、0.05%濃度,分別取0.2 mL按組織的操作表進(jìn)行檢測(cè)。
c. 測(cè)定結(jié)果:通過(guò)非酶管OD值-酶管OD值在0.2左右時(shí),作為最佳取樣濃度。
三. 全血中GSH-PX活力的測(cè)定
1. 樣本前處理(溶血液的配制)
1)取人肝素抗凝全血20 μL,以蒸餾水稀釋至1 mL,配成1:49的溶血液;鼠血10 μL加蒸餾水至1 mL,配成1∶99的溶血液。充分混勻,放置5 min直至使玻璃管中的溶血液對(duì)光呈完全透明狀,方可進(jìn)行檢測(cè)。
2)已配好的溶血液中GSH-PX活力只能保持45-60 min,天冷時(shí)可延遲至120 min。如果當(dāng)天來(lái)不及測(cè)定則以抗凝全血冰箱(2℃-8℃)保存,2-3天內(nèi)酶活力變化不大。
【注】請(qǐng)?jiān)谡綄?shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)。
【注】測(cè)溶血液中GSH-PX含量要注意樣品測(cè)試前紅細(xì)胞一定要充分溶血。(以對(duì)光觀察透亮為標(biāo)準(zhǔn),若不透亮可以凍溶一次,但有部分大鼠及豬的紅細(xì)胞是不可放置0℃以下,否則不易溶血,例如糖尿病大鼠和部分正常大鼠的紅細(xì)胞凍后很難溶血。在做正式實(shí)驗(yàn)前最好先取1-2只樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。)
2. 操作方法
1)酶促反應(yīng):(試劑一應(yīng)用液提前5 min在37℃預(yù)溫)
表5 加樣方法
加樣種類 |
非酶管 |
酶管 |
1 mmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液(mL) |
0.2 |
0.2 |
待測(cè)溶血液(mL) |
/ |
0.2 |
37℃預(yù)溫5分鐘 |
||
試劑一應(yīng)用液(mL) |
0.1 |
0.1 |
37℃準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘 |
||
試劑二應(yīng)用液(mL) |
2 |
2 |
待測(cè)溶血液(mL) |
0.2 |
/ |
混勻,3500-4000 rpm,離心10 min,取上清1 mL作顯色反應(yīng) |
【注】1 mmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液配制:測(cè)定前取1瓶GSH標(biāo)準(zhǔn)品粉末(60746-H)加到10 mL試劑七應(yīng)用液(標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液)中,充分溶解配成1 mmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液,配好后可置于2~8℃保存1-2周。
【注】正式實(shí)驗(yàn)前,請(qǐng)先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),預(yù)實(shí)驗(yàn)后再進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)。
2)顯色反應(yīng)
表6 加樣方法
加樣種類 |
空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
非酶管 |
酶管 |
標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液(mL) |
1.0 |
/ |
/ |
/ |
20 μmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液(mL) |
/ |
1.0 |
/ |
/ |
上清液(mL) |
/ |
/ |
1.0 |
1.0 |
試劑四應(yīng)用液(mL) |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
顯色劑應(yīng)用液(mL) |
0.25 |
0.25 |
0.25 |
0.25 |
試劑六應(yīng)用液(mL) |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
混勻,室溫靜置15 min后,倒入1 cm光徑比色杯中,蒸餾水調(diào)零,波長(zhǎng)412 nm處,測(cè)各管OD值 |
【注】20 μmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液配制:取 1 mmol/L GSH溶液0.2 mL加標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液定容至10 mL充分混勻配成,現(xiàn)用現(xiàn)配。
3. 全血中GSH-PX酶活力的計(jì)算
a. 定義:每毫升全血在37℃每分鐘,扣除非酶促反應(yīng)作用,使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個(gè)酶活力單位(U)。
b. 計(jì)算公式:
C標(biāo)準(zhǔn):顯色反應(yīng)中的GSH標(biāo)準(zhǔn)液濃度,20 μmol/L;
N:酶促反應(yīng)體系稀釋倍數(shù),5(2.5 mL/0.5 mL,固定值);
T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;
V樣:樣本取樣量,0.2 mL;
N樣:全血制備成溶血液過(guò)程中的稀釋倍數(shù);
3. 溶血液的最佳取樣濃度摸索舉例
a. 樣本來(lái)源:正常組新鮮大鼠尾部肝素抗凝全血。
b. 樣本前處理:分別用蒸餾水將大鼠全血按1︰49、1︰59、1︰69、1︰79、1 ︰89、1︰99、1︰149、1︰199的比例稀釋成不同濃度的溶血液,分別取0.2 mL按全血的操作表進(jìn)行檢測(cè)。
c. 測(cè)定結(jié)果:通過(guò)公式:,選取抑制率在45%-55%之間的,作為最佳取樣濃度。
四. 預(yù)實(shí)驗(yàn)相關(guān)事項(xiàng)
注意事項(xiàng)
1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。
2. 為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
3. 溶血液在室溫下1小時(shí)內(nèi)活力不變,建議樣品稀釋后不超過(guò)1小時(shí)測(cè)試為宜。
4. 血樣要新鮮,肝素抗凝后放冰箱2-8℃存放不要超過(guò)48 h。
5. 測(cè)溶血液中GPX活性要注意樣品測(cè)試前紅細(xì)胞一定要充分溶血。(以對(duì)光觀察透亮為標(biāo)準(zhǔn),若不透亮可以凍溶一次,但有部分大鼠及豬的紅細(xì)胞是不可凍溶,越凍越不破,最好先取1-2只樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn))。
6. 酶促反應(yīng)離心后有懸浮物無(wú)法分離時(shí),可加入0.1 mL氯仿渦旋震蕩30 s再離心。
7. 37℃水浴反應(yīng)時(shí)間5 min,記錄反應(yīng)時(shí)間要準(zhǔn)確。
8. 有的樣本酶管OD值和非酶管OD值接近,此為樣本GPX活性較低的緣故(且計(jì)算結(jié)果誤差會(huì)比較大),這種情況可考慮增加樣本濃度或樣本量以及延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間來(lái)改善測(cè)試效果。
9. 樣本勻漿上清液當(dāng)天提取,當(dāng)天測(cè)試濃度。
10. 試劑二應(yīng)用液配置時(shí):試劑二粉末溶解時(shí)不要用水浴鍋加熱,不要用隔水加熱的方式(因受熱較慢導(dǎo)致溶解困難),最好用能直接加熱的設(shè)備( 如電爐、酒精燈之類的) 加熱,且加熱時(shí)不斷攪拌;試劑二應(yīng)用液配好后為過(guò)飽和溶液,室溫靜置冷卻后,如有結(jié)晶,則取上清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)即可。
11. 正式實(shí)驗(yàn)前,請(qǐng)先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),預(yù)實(shí)驗(yàn)后再進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn),否則由此導(dǎo)致的后果用戶自行承擔(dān)。
Ver.CN20240829