產(chǎn)品簡介

 

本產(chǎn)品是由大腸桿菌重組表達(dá)來源的噬菌體T7 RNA聚合酶組成的混合物，以含有T7啟動子序列（5’-TAATACGACT CACTATA-3’）的雙鏈DNA為模板，以NTPs為底物，合成與啟動子下游的反向單鏈DNA互補(bǔ)的RNA。雙鏈線性平末端或5’突出末端DNA均可作為T7 RNA聚合酶的底物模板，因此線性質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物均可用作體外合成RNA的模板。轉(zhuǎn)錄時可在底物中加入修飾的核苷酸，制備生物素或染料標(biāo)記的RNA。

 

產(chǎn)品信息

 

貨號	10631ES20 / 10631ES60 / 10631ES70 / 10631ES80
規(guī)格	20 μL / 100 μL / 200 μL / 1mL

 

組分信息

 

組分名稱	10631ES20	10631ES60	10631ES70	10631ES80
T7 RNA Polymerase Mix	20 μL	100 μL	200 μL	1 mL

 

儲存條件

 

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用說明

 

1. DNA模板制備

帶有雙鏈T7啟動子的線性化質(zhì)?；騊CR擴(kuò)增產(chǎn)物都可以作為體外轉(zhuǎn)錄模板，模板可以用TE緩沖液或RNase free H₂O溶解。

T7啟動子序列： TAATACGACTCACTATA(G/A)*GG   （注：(G/A)*為RNA轉(zhuǎn)錄的第一個堿基）

 

圖1：RNA體外轉(zhuǎn)錄過程

1）質(zhì)粒模板

將目的DNA插入含有T7啟動子的質(zhì)粒載體中，然后用限制酶進(jìn)行處理，待完全線性化后進(jìn)行純化。

注：

1. 環(huán)狀質(zhì)粒由于沒有有效的終止，會轉(zhuǎn)錄出不同長度的RNA產(chǎn)物，為了得到特定長度的RNA，質(zhì)粒必須完全線性化。
2. 質(zhì)粒線性化所選限制酶需要在啟動子區(qū)域右側(cè)、插入DNA片段的下游，且在插入DNA片段中無識別位點(diǎn)。選擇的限制酶要能形成5’突出或者平滑末端。
3. 為了避免蛋白及鹽離子等對體系的影響，質(zhì)粒線性化后建議純化后再作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

圖2：線性化質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄過程

2）PCR產(chǎn)物模板

帶T7啟動子的PCR產(chǎn)物可以作為體外轉(zhuǎn)錄模板。首先將T7啟動子序列(TAATACGA CTCACTATA(G/A)GG)加在有義鏈的上游引物的5’端，然后在高保真酶的作用下擴(kuò)增含T7啟動子的DNA模板，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。PCR產(chǎn)物可以不經(jīng)純化直接作為模板，但純化后會得到更高的RNA產(chǎn)出。

注：

1. PCR產(chǎn)物作為模板，必須電泳確認(rèn)產(chǎn)物的特異性及濃度，建議20μL反應(yīng)體系投入2-5μL PCR產(chǎn)物。
2. 為了得到更多高品質(zhì)的RNA，推薦PCR產(chǎn)物膠回收之后再作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

2.RNA體外轉(zhuǎn)錄

1）試劑解凍

將T7 RNA Polymerase Mix短暫離心，置于冰上。將除 T7 RNA Polymerase Mix外的其他所需組分解凍并振蕩混勻，短暫離心收集于管底，10×Transcription Buffer置于室溫，其他組分置于冰上，備用。

注：本產(chǎn)品不包含10×Transcription Buffer（貨號：10670）和核糖核苷酸（貨號：10652-10655）。

2）室溫裝配轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

表1 非修飾RNA配制體系

組分	體積（μL）	終濃度
RNase free H2O	Up to 20	-
10×Transcription Buffer	2	1×
CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each)	2 each	10 mM each
模板DNA	1 μg	-
T7 RNA Polymerase Mix	2	-

表2 修飾RNA配制體系

組分	體積（μL）	終濃度
RNase free H2O	Up to 20	-
10×Transcription Buffer	2	1×
修飾型CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each)	2 each	10 mM each
模板DNA	1 μg	-
T7 RNA Polymerase Mix	2	-

修飾型NTP如：pUTP，N¹-Me-pUTP，5-Me-CTP， 5-OMe-UTP等

表3 共轉(zhuǎn)錄RNA配制體系

組分	體積（μL）	終濃度
RNase free H2O	Up to 20	-
10×Transcription Buffer	2	1×
CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each)	2 each	10 mM each
Cap1 Analog (100mM)	2	10 mM
模板DNA	1 μg	-
T7 RNA Polymerase Mix	2	-

注：

1. 反應(yīng)于室溫配置。由于10×Transcription Buffer中含有亞精胺，低溫下亞精胺濃度過高會引起DNA模板沉淀。
2. 短轉(zhuǎn)錄本（<100nt），模板可使用2ug，轉(zhuǎn)錄時間增至4-8個小時。
3. 長轉(zhuǎn)錄本（>1000nt），建議使用質(zhì)粒線性化模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
4. 建議在PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，熱蓋打開，防止長時間導(dǎo)致反應(yīng)液蒸發(fā)。
5. 反應(yīng)產(chǎn)物可能有白色沉淀。這是反應(yīng)過程中游離的焦磷酸與反應(yīng)液中的鎂離子形成焦磷酸鎂，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如想去除，添加EDTA即可消失。添加EDTA如果影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，也可以離心回收上清。
6. 使用試劑、容器等無RNase污染。

3）37℃孵育2-3個小時

將上述反應(yīng)液混合均勻，短暫離心至管底，37℃孵育2-3個小時。若轉(zhuǎn)錄本長度小于100nt，增加反應(yīng)時間至4-8個小時。

4）DNaseⅠ處理（可選）

反應(yīng)完成后，每管加入1 μL DNaseⅠ（RNase free）（貨號：10611），37℃孵育15min以去除模板DNA。

3.產(chǎn)物純化

轉(zhuǎn)錄后的RNA可以選用RNA Cleaner磁珠進(jìn)行純化（貨號：12602），也可以采用酚/氯仿純化法，氯化鋰沉淀法或柱純化等，以去除蛋白、游離的核苷酸。純化后的RNA經(jīng)電泳檢測后可進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)或存儲于-80℃。

1）RNA Cleaner磁珠純化法

提前將RNA clean beads從4 ℃取出，平衡至室溫（約30 min），并用RNase free H₂O將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至50μL。

1. 顛倒或渦旋振蕩使磁珠充分混勻，吸取2×磁珠（100μL）加入RNA樣品中（50μL），用移液器吹打6次充分混勻。室溫孵育5 min，使RNA結(jié)合到磁珠上。
2. 將樣品置于磁力架上5 min，待溶液澄清后，小心移除上清。
3. 保持樣品置于磁力架上，加入200μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 s，小心移除上清。重復(fù)此操作一次。（注：漂洗時使用的80%乙醇需要使用RNase free H₂O新鮮配制，以防止引入RNase酶導(dǎo)致RNA降解。）
4. 保持樣品始終處于磁力架上，開蓋空氣干燥磁珠5 min。（注：磁珠開蓋晾干時要避免過分干燥，如果磁珠出現(xiàn)龜裂，則提示磁珠過分干燥，此時RNA的洗脫效率會降低）。
5. 將樣品從磁力架上取出，加入22μL RNase free H₂O，用移液器吹打6次以充分混勻，室溫靜置5 min。
6. 將樣品置于磁力架5 min，待溶液澄清后，小心轉(zhuǎn)移上清20μL至一個新的RNase free PCR管中。（注：建議轉(zhuǎn)移上清時留2-3μL液體，以免吸到磁珠影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。得到的RNA極不穩(wěn)定，建議盡快進(jìn)入下一步。若要保存，請置于-80℃保存。）

2）酚/氯仿純化法

1. 向20μL反應(yīng)混合物中，加入115μL RNase free H₂O和15μL 3M乙酸鈉（pH5.2），混合均勻。
2. 用等體積的酚/氯仿（1:1）抽提一次，再用等體積的氯仿抽提2次，收集上清，并轉(zhuǎn)移至新的RNase free EP管中。
3. 加入2倍體積的無水乙醇沉淀RNA?；旌暇鶆蚝笾糜?20℃至少30min，以最大轉(zhuǎn)速，4℃離心15min，收集沉淀。
4. 加入500μL冰預(yù)冷的70%乙醇洗滌RNA沉淀。
5. 用20μL RNase free H2O溶解RNA沉淀。純化后的RNA溶液于-80℃保存。

3）氯化鋰沉淀法

采用氯化鋰沉淀法，RNA長度要大于300nt，且濃度不能低于100ng/μL。

1. 向20μL反應(yīng)混合物中，加入30μL RNase free H₂O和30μL 7.5M氯化鋰。
2. 混合均勻后，置于-20℃至少30min，以最大轉(zhuǎn)速，4℃離心15min，收集沉淀。
3. 加入500μL冰預(yù)冷的70%乙醇洗滌RNA沉淀。
4. 用20μL RNase free H₂O溶解RNA沉淀。純化后的RNA溶液于-80℃保存。

純化前加入80μL RNase free H₂O將產(chǎn)物稀釋至100μL，再按柱純化說明書進(jìn)行純化。

4. RNA定量

1）紫外吸收法

游離核苷酸會影響定量的準(zhǔn)確性，采用此方法前請先進(jìn)行RNA純化。然后通過測定產(chǎn)物的A260讀數(shù)來確定RNA的產(chǎn)量。對于單鏈RNA，1 A260相當(dāng)于40µg/mL，所以RNA的產(chǎn)量可以如下計算：  A260 x 稀釋倍數(shù) x 40 = µg/mL RNA

2）染料法

用RiboGreen染料進(jìn)行RNA定量，游離核苷酸不會影響定量，可以對純化或未純化的反應(yīng)產(chǎn)物中的RNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

5. RNA大小及質(zhì)量檢測

1）瓊脂糖電泳法

為了確定RNA的大小，完整度以及質(zhì)量，需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。

2）Agilent Bioanalyzer檢測法

可以用來評估RNA完整度及質(zhì)量，它僅需要少量的RNA進(jìn)行分析，高品質(zhì)的RNA在電圖上應(yīng)呈現(xiàn)明顯且銳利的峰。

 

注意事項(xiàng)

 

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

3. 反應(yīng)體系中須嚴(yán)格注意不要混入RNase。

4. 實(shí)驗(yàn)器材（如：槍頭、產(chǎn)品管等）注意嚴(yán)格使用 RNase Free用品。

 

 

Ver.CN20250122