產品簡介

 

T7 High Yield RNA Synthesis Kit(low dsRNA)進行了轉錄反應體系的優(yōu)化，試劑盒使用的T7 RNA聚合酶是對野生型T7 RNA聚合酶進行了改造優(yōu)化，突變得到的可以大幅度降低dsRNA含量的T7 RNA 聚合酶，以含有T7 啟動子序列的線型雙鏈DNA為模板，以NTPs為底物，對啟動子下游的DNA序列進行轉錄，高效合成單鏈RNA。轉錄時可在底物中加入修飾的核苷酸，制備生物素或染料標記的RNA。

本試劑盒可以合成長轉錄本以及短轉錄本，以1 μg的模板投入量可以產生100-200 μg的RNA，轉錄合成的RNA可用于諸如RNA結構與功能研究、RNA酶保護、探針雜交、RNAi、顯微注射及體外翻譯等多方面的下游應用。

 

產品信息

 

貨號	10633ES10 / 10633ES50 / 10633ES60 / 10633ES70
規(guī)格	10 T / 50 T / 100 T / 500 T

 

組分信息

 

編號	組分名稱	10633ES10	10633ES50	10633ES60	10633ES70
10633-A	T7 RNA Polymerase Mix(low dsRNA)	20 μL	100 μL	200 μL	1 mL
10633-B	10×Transcription Buffer	20 μL	100 μL	200 μL	1 mL
10633-C	ATP（100mM）	20 μL	100 μL	200 μL	1 mL
10633-D	CTP（100mM）	20 μL	100 μL	200 μL	1 mL
10633-E	GTP（100mM）	20 μL	100 μL	200 μL	1 mL
10633-F	UTP（100mM）	20 μL	100 μL	200 μL	1 mL
10633-G	Control DNA Template（500ng/μL）	5 μL	10 μL	20 μL	100 μL
10633-H	DNase I (2 U/μL)	10 μL	50 μL	100 μL	500 μL
10633-I	Lithium chloride solution	300 μL	1.5 mL	3 mL	15 mL
10633-J	RNase-free ddH2O	500 μL	2.5 mL	5 mL	25 mL

 

儲存條件

 

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用說明

 

1. DNA模板制備

帶有雙鏈T7啟動子的線性化質?；騊CR擴增產物都可以作為體外轉錄模板，模板可以用TE緩沖液或RNase free H₂O溶解。

T7啟動子序列： TAATACGACTCACTATA(G/A)*GG   （注：(G/A)*為RNA轉錄的第一個堿基）

 

圖1：RNA體外轉錄過程

1）質粒模板

將目的DNA插入含有T7啟動子的質粒載體中，然后用限制酶進行處理，待完全線性化后進行純化。

注：

1. 環(huán)狀質粒由于沒有有效的終止，會轉錄出不同長度的RNA產物，為了得到特定長度的RNA，質粒必須完全線性化。
2. 質粒線性化所選限制酶需要在啟動子區(qū)域右側、插入DNA片段的下游，且在插入DNA片段中無識別位點。選擇的限制酶要能形成5’突出或者平滑末端。
3. 為了避免蛋白及鹽離子等對體系的影響，質粒線性化后建議純化后再作為模板進行體外轉錄。

2）PCR產物模板

帶T7啟動子的PCR產物可以作為體外轉錄模板。首先將T7啟動子序列(TAATACGA CTCACTATA(G/A)GG)加在有義鏈的上游引物的5’端，然后在高保真酶的作用下擴增含T7啟動子的DNA模板，隨后進行轉錄。PCR產物可以不經純化直接作為模板，但純化后會得到更高的RNA產出。

注：

1. PCR產物作為模板，必須電泳確認產物的特異性及濃度，建議20μL反應體系投入2-5μL PCR產物。
2. 為了得到更多高品質的RNA，推薦PCR產物膠回收之后再作為模板進行體外轉錄。

2. RNA體外轉錄

1）試劑解凍

將T7 RNA Polymerase Mix(low dsRNA)短暫離心，置于冰上。將除 T7 RNA Polymerase Mix(low dsRNA)外的其他所需組分解凍并振蕩混勻，短暫離心收集于管底，10×Transcription Buffer置于室溫，其他組分置于冰上，備用。

2）室溫裝配轉錄反應

表1 體外轉錄體系配制

組分	體積（μL）	終濃度
RNase free H2O	Up to 20	-
10×Transcription Buffer	2	1×
CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each)	2 each	10 mM each
模板DNA	1 μg	-
T7 RNA Polymerase Mix(low dsRNA)	2	-

注：

1. 反應于室溫配置。由于10×Transcription Buffer中含有亞精胺，低溫下亞精胺濃度過高會引起DNA模板沉淀。
2. 短轉錄本（<100nt），模板可使用2ug，轉錄時間增至4-8個小時。
3. 長轉錄本（>1000nt），建議使用質粒線性化模板進行轉錄。
4. 建議在PCR儀中進行反應，熱蓋打開，防止長時間導致反應液蒸發(fā)。
5. 反應產物可能有白色沉淀。這是反應過程中游離的焦磷酸與反應液中的鎂離子形成焦磷酸鎂，不影響后續(xù)實驗。如想去除，添加EDTA即可消失。添加EDTA如果影響后續(xù)實驗，也可以離心回收上清。
6. 使用試劑、容器等無RNase污染。

3）37℃孵育2-3個小時

將上述反應液混合均勻，短暫離心至管底，37℃孵育2-3個小時。若轉錄本長度小于100nt，增加反應時間至4-8個小時。

4）DNaseⅠ處理（可選）

反應完成后，每管加入1 μL DNaseⅠ，37℃孵育15min以去除模板DNA。

3. 產物純化

轉錄后的RNA可以使用氯化鋰沉淀法，以去除蛋白、游離的核苷酸。純化后的RNA經電泳檢測后可進行下游實驗或存儲于-80℃。

采用氯化鋰沉淀法，RNA長度要大于300nt，且濃度不能低于100ng/μL。

1. 向20μL反應混合物中，加入30μL RNase free H₂O和30μL氯化鋰。
2. 混合均勻后，置于-20℃至少30min，以最大轉速，4℃離心15min，收集沉淀。
3. 加入500μL冰預冷的70%乙醇洗滌RNA沉淀。
4. 用20μL RNase free H₂O溶解RNA沉淀。純化后的RNA溶液于-80℃保存。

4. RNA定量

1）紫外吸收法

游離核苷酸會影響定量的準確性，采用此方法前請先進行RNA純化。然后通過測定產物的A260讀數(shù)來確定RNA的產量。對于單鏈RNA，1 A260相當于40µg/mL，所以RNA的產量可以如下計算：  A260 x 稀釋倍數(shù) x 40 = µg/mL RNA

2）染料法

用RiboGreen染料進行RNA定量，游離核苷酸不會影響定量，可以對純化或未純化的反應產物中的RNA進行準確定量。

5. RNA大小及質量檢測

1）瓊脂糖電泳法

為了確定RNA的大小，完整度以及質量，需要進行瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。

2）Agilent Bioanalyzer檢測法

可以用來評估RNA完整度及質量，它僅需要少量的RNA進行分析，高品質的RNA在電圖上應呈現(xiàn)明顯且銳利的峰。

 

注意事項

 

1. 本產品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

3. 反應體系中須嚴格注意不要混入RNase。

4. 實驗器材（如：槍頭、產品管等）注意嚴格使用 RNase Free用品。

 

 

 

Ver.CN20250122