產(chǎn)品簡介

 

已知，無論是生命科學(xué)研究還是生物制品生產(chǎn)，都會涉及到生物源材料的使用，其中包括來源于微生物、動物和人的細胞、組織、體液成分等?？紤]到生產(chǎn)的藥物的安全性，需要對起始物料、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)環(huán)境等進行嚴格監(jiān)控，防止有細菌、真菌等微生物污染。細菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的特有結(jié)構(gòu)，細菌在存活狀態(tài)時不釋放出來，但會在細菌死亡后的裂解大量釋放。微量的內(nèi)毒素進入機體就能引起發(fā)熱休克等嚴重反應(yīng)，從而影響生物制品的安全性。2020版《中國藥典》（三部）針對細菌內(nèi)毒素檢測，收錄了包括凝膠法和光度法在內(nèi)的共6種細菌內(nèi)毒素檢查方法。

本產(chǎn)品就是采用凝膠法對內(nèi)毒素進行定性或者半定量檢測的鱟試劑。由于，鱟試劑中含有C因子、B因子、凝固酶原和凝固蛋白原等。在適宜的條件下（如：溫度、pH值及無干擾物質(zhì)等），細菌內(nèi)毒素能激活C因子，引起一系列酶促反應(yīng)，使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠。

本鱟試劑為鱟科動物東方鱟血液中的變性細胞經(jīng)裂解后提取到的一種細胞溶解物凍干品，其能與極微量的細菌內(nèi)毒素形成特異性的凝膠反應(yīng)，反應(yīng)的速度和凝膠的堅固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)。

 

組分信息

 

組分編號	組分名稱	60453ES03	60453ES08	60453ES10
60453-A	鱟試劑（0.06 EU/mL，0.1 mL/支）	1支	5支	10支

 

儲存條件

 

2~8℃保存，有效期2年。

 

注意事項

 

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途，僅供體外鱟試驗檢測，嚴禁用于人體。

2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本試劑前請仔細閱讀說明書，實驗應(yīng)規(guī)范操作，包括細菌內(nèi)毒素標準品溶解、稀釋及加樣。

4. 實驗過程中所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素，常用的方法是干熱滅菌法（即250℃干烤≥30 min）；也可以采用其他確保不干擾內(nèi)毒素檢查的方法。若使用塑料器械，應(yīng)選用標明無內(nèi)毒素并對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應(yīng)防止微生物的污染。

5. 需采用細菌內(nèi)毒素國家標準品或工作標準品復(fù)核本鱟試劑的靈敏度值，應(yīng)為標示值的50%~200%。

6. 本產(chǎn)品為一次性的試劑。

 

使用說明

 

1. 實驗前準備

1）提前準備實驗所需試劑和耗材：

如：細菌內(nèi)毒素工作標準品(Cat#60451ES)、細菌內(nèi)毒素檢查用水(Cat#60456ES10)、無熱原吸頭^*和無熱原玻璃試管(Cat#60457ES)等。

^*推薦您購買翌圣生物200 μL加長吸頭盒裝滅菌（Cat#83051ES）、1000 μL盒裝藍色無菌吸頭（Cat#83080ES）。

2）自備實驗所需設(shè)備和儀器：

如：渦旋振蕩器、250℃加熱和干燥烘箱、移液器、恒溫水浴鍋或干式恒溫金屬浴(37±1℃)等。

2. 實驗方法

1）準備超凈工作臺：

提前30 min開啟超凈工作臺，試驗操作過程中不要開啟風(fēng)機，試驗完畢后用75%乙醇擦拭超凈工作臺。試驗操作過程應(yīng)防止微生物和細菌內(nèi)毒素污染。

2）溶解和稀釋細菌內(nèi)毒素標準品：

a. 取1支細菌內(nèi)毒素工作標準品（凝膠法檢測用）(Cat#60451ES)，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸上部劃痕，用75%乙醇擦拭后啟開，避免玻璃屑落入瓶內(nèi)。

b. 按照工作標準品說明書，加入細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，封口膜封口，置漩渦混合器上混勻15 min。然后加入細菌內(nèi)毒素檢查用水進行稀釋，將其稀釋成2λ、λ、0.5λ和0.25λ等一系列濃度的內(nèi)毒素標準溶液（λ為鱟試劑靈敏度標示值）。

c. 每步稀釋操作均需在渦旋振蕩器上混勻1 min。并且稀釋的內(nèi)毒素溶液靜置時間超過10 min，用前也需在渦旋振蕩器上劇混勻1 min，放置4 h以上的內(nèi)毒素溶液應(yīng)丟棄。

3）準備供試品（即待測樣品）：

1. 所有與待測樣品或測試試劑直接接觸的材料均應(yīng)無熱原。
2. 待測樣品的稀釋要在無熱原玻璃管中用無熱原水進行，避免微生物或內(nèi)毒素污染；若不及時檢測，建議冷藏或冷凍保存。
3. 待測樣品的稀釋倍數(shù)應(yīng)小于待測樣品的最大有效稀釋倍數(shù)，待測樣品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的計算公式如下：

MVD=內(nèi)毒素限度^*（EU/mL）/測定靈敏度^*（0.06 EU/mL）

^*內(nèi)毒素限度：未稀釋樣品中可接受的內(nèi)毒素濃度最大值。

^*測定靈敏度：測定試劑的最低檢測限度（本試劑盒的最低檢測限度為0.06 EU/mL）。

4. 對內(nèi)毒素檢測無干擾^*的樣品可直接用于檢測；對內(nèi)毒素檢測有干擾（增強或者抑制）的樣品需稀釋至不干擾檢測的濃度，稀釋過程應(yīng)充分漩渦震蕩≥2 min；通常內(nèi)毒素檢測干擾是由于樣品中組分的濃度過高，因此大多數(shù)情況下，通過適度的稀釋甚至調(diào)節(jié)pH值克服對內(nèi)毒素檢測的干擾。

^*判斷待測樣品是否對內(nèi)毒素檢測有干擾，可先進行干擾試驗，然后再開展鱟試劑的內(nèi)毒素檢測實驗。

5. 待測樣品的pH^*需維持在6~8之間。若樣品的pH值不在此范圍內(nèi)，則需要使用無內(nèi)毒素的氫氧化鈉、鹽酸或其它緩沖溶液進行調(diào)節(jié)。

^*待測樣品不能直接進行pH調(diào)節(jié)，以免被pH電極污染內(nèi)毒素導(dǎo)致假陽性，務(wù)必預(yù)實驗考察適宜的pH調(diào)節(jié)方法。

f. 除了內(nèi)毒素，鱟試劑還與某些β-葡聚糖反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。如遇含有β-葡聚糖的待測樣品，可使用去G因子鱟試劑或G因子反應(yīng)抑制劑來排除鱟試劑與β-葡聚糖的反應(yīng)。

4）實驗操作：

a. 溶解鱟試劑：取4支本凝膠法的鱟試劑（安瓿瓶裝）^**，安瓿開啟過程同2.1).a.內(nèi)毒素工作標準品。按每瓶上標示量各加入0.1 mL細菌內(nèi)毒素檢查用水(Cat#60456ES)，輕輕振搖使鱟試劑完全溶解^*。

^*注意不要引起氣泡，溶解后的鱟試劑應(yīng)在10 min內(nèi)使用（即配即用）。

^**如果使用安瓿瓶操作不便，則可將4支溶解后的鱟試劑分別分裝在無熱原玻璃試管(Cat#60457ES)中。

b. 分別向上述4支裝有溶解了鱟試劑的安瓿瓶或者無熱原玻璃試管中加入0.1 mL陰性對照^*、0.1 mL陽性對照^**、0.1 mL待測樣品、0.1 mL待測樣本陽性對照。

^*陰性對照：細菌內(nèi)毒素檢查用水；

^**陽性對照：濃度為2λ（即0.12 EU/mL）內(nèi)毒素標準品溶液;

^***待測樣本陽性對照：含2λ（即0.12 EU/mL）內(nèi)毒素標準品溶液的待測樣本。

c. 封閉管口，輕輕搖勻，垂直放入37±1℃的恒溫器(水浴箱或干熱恒溫儀)中孵育60±2 min，孵育期間避免振動。孵育結(jié)束后，取出觀察結(jié)果。

5）結(jié)果判斷：

a. 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩慢倒轉(zhuǎn)180°。若管內(nèi)形成凝膠，且不變形也不從管壁滑脫，則為陽性，記錄為(+)；若管內(nèi)未形成凝膠或雖生成凝膠但不能保持完整并從管壁滑脫，則為陰性，記錄為(一)。

b. 在陰性對照管結(jié)果為陰性，陽性對照管和供試品陽性對照管結(jié)果均為陽性的前提下，待測樣品的實驗結(jié)果才有效，否則實驗結(jié)果無效。

3. 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗

當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響實驗結(jié)果的改變時，應(yīng)按《中華人民共和國藥典》2020版中《細菌內(nèi)毒素檢查法》的“鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗”進行試驗，具體操作如下：

1）根據(jù)本鱟試劑靈敏度的標示值（λ，即0.06 EU/mL），將細菌內(nèi)毒素工作標準品^*（凝膠法檢測用）(Cat#60451ES)先用內(nèi)毒素檢查用水溶解，再稀釋成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度梯度。

^*細菌內(nèi)毒素工作標準品的安瓿開啟過程和超凈工作臺準備過程、實驗注意細節(jié)等同2.實驗方法。

2）取本凝膠法鱟試劑（安瓿瓶裝）18支，每支加入0.1 mL內(nèi)毒素檢查用水溶解^*，搖勻，然后將其混勻。

^*鱟試劑復(fù)溶后不能放到漩渦混合器上混合，因為強烈混合容易使復(fù)溶后的鱟試劑產(chǎn)生泡沫，影響凝膠的形成。

3）將上述18支鱟試劑按下表進行分組加不同濃度的內(nèi)毒素標準品和內(nèi)毒素檢查用水：

組別	每組重復(fù)支數(shù)	每支加入的試劑*	終溶液
組1	4	0.1 mL 2λ濃度的細菌內(nèi)毒素標準溶液	待觀察樣品
組2	4	0.1 mL λ濃度的細菌內(nèi)毒素標準溶液	待觀察樣品
組3	4	0.1 mL 0.5λ濃度的細菌內(nèi)毒素標準溶液	待觀察樣品
組4	4	0.1 mL 0.25λ濃度的細菌內(nèi)毒素標準溶液	待觀察樣品
組5	2	0.1 mL細菌內(nèi)毒素檢查用水	陰性對照

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗樣品配制

^*每次加樣濃度必須是從高到低，加不同濃度的樣品需更換新的移液器吸嘴。

圖1 鱟試劑安瓿排列圖^*

^*圖中1、2、3、4、5列對應(yīng)上表中的組1、組2、組3、組4、組5。

4）加樣結(jié)束后，用封口膜封口，將鱟試劑安瓿中溶液輕輕混勻，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架垂直放入37±1℃的恒溫水浴箱中^*，試管架保持水平狀態(tài)，保溫60±2 min。

^*使用溫度計監(jiān)測恒溫水浴箱溫度是否滿足實驗要求，每30 min進行溫度記錄。

5）結(jié)果判斷及計算：

a. 將鱟試劑安瓿從恒溫器中輕輕取出，緩慢倒轉(zhuǎn)180°。若管內(nèi)形成凝膠，且不變形也不從管壁滑脫，則為陽性，記錄為(+)；若管內(nèi)未形成凝膠或雖生成凝膠但不能保持完整并從管壁滑脫，則為陰性，記錄為(一)。

b. 在陰性對照管結(jié)果為陰性，陽性對照管和供試品陽性對照管結(jié)果均為陽性的前提下，待測樣品的實驗結(jié)果才有效，否則實驗結(jié)果無效。

c. 當最大濃度2λ的4個重復(fù)管均為陽性，最低濃度0.25λ的4個重復(fù)管均為陰性，陰性對照的2個重復(fù)管也為陰性，試驗才算有效。

d. 按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值(λ_c)。

λ_c=antilg（∑X/n）

X：反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)。反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。

N：每個濃度的平行管數(shù)（或重復(fù)管數(shù)）。

當λ_c在0.5~2λ(包括0.5λ和2λ)時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

4. 干擾實驗

當供試品中可能存在鱟試驗的干擾物質(zhì)時；當鱟試劑、供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時；當對新藥或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時；都必須按《中華人民共和國藥典》2020版中《細菌內(nèi)毒素檢查法》的“干擾試驗”進行干擾試驗。具體操作如下：

1）按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗開展下述操作。

編號	內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液	內(nèi)毒素稀釋用液	稀釋倍數(shù)	所含內(nèi)毒素濃度	平行管數(shù)
A*	0/供試品	NA	NA	NA	2
B**	2λ/供試品	供試品溶液	1 2 4 8	2λ λ 0.5λ 0.25λ	4 4 4 4
C***	2λ/細菌內(nèi)毒素檢查用水	細菌內(nèi)毒素檢查用水	1 2 4 8	2λ λ 0.5λ 0.25λ	2 2 2 2
D****	0/細菌內(nèi)毒素檢查用水	NA	NA	NA	2

表2 凝膠法鱟試劑干擾試驗溶液的配制

^*A：為供試品溶液；

^**B：為干擾試驗系列；

^***C：為鱟試劑標示靈敏度對照系列；

^****D：為陰性對照。

2）當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗要求時，試驗方

為有效。

3）當系列溶液B的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗要求時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若出現(xiàn)其他情況，則認為供試品在該濃度下存在干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應(yīng)將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋^*，再重復(fù)干擾試驗。

^*可通過對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法(如過濾、中和、透析或加熱處理等)排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標準內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進行干擾試驗。

 

 

Ver.CN20241216