潮霉素B（Hygromycin B）是由吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，通過(guò)干擾70S核糖體易位和誘導(dǎo)對(duì)mRNA模板的錯(cuò)讀而抑制蛋白合成，從而殺死原核（如細(xì)菌）、真核（如酵母菌，真菌）和高等哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞。

大腸桿菌（ Escherichia coli.）來(lái)源的潮霉素抗性基因（hyg或hph），編碼潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶，將潮霉素B轉(zhuǎn)化成不具有生物活性的磷酸化產(chǎn)物，從而起到解毒作用。針對(duì)這一原理，潮霉素B是一種非常有用的選擇性標(biāo)記，用來(lái)篩選和維持培養(yǎng)成功轉(zhuǎn)染潮霉素抗性基因的原核或者真核細(xì)胞。另外，由于作用模式的差異，常與G418 (GeneticinTM)，Zeocin™ 和Blasticidin S聯(lián)合使用進(jìn)行雙抗性陽(yáng)性細(xì)胞株的選擇。潮霉素B還能用作抗病毒劑，因其選擇性滲透進(jìn)入因病毒感染增強(qiáng)通透性的細(xì)胞，且具有抑制翻譯的功效。還可混合入動(dòng)物飼料中起到驅(qū)蟲功能。

本品是無(wú)菌的潮霉素B溶液（50 mg/mL in PBS buffer），可直接用培養(yǎng)液稀釋使用。

 

產(chǎn)品信息

貨號(hào)	60224ES03 / 60224ES10
規(guī)格	1 g (20 mL) / 10×1g(20mL)
CAS號(hào)（CAS NO.）	31282-04-9
分子式（Molecular Fomular）	C20H37N3O13
分子量（Molecular Weight）	527.52 g/mol
外觀（Appearance）	液體
純度（Purity）	＞90% by HPLC
結(jié)構(gòu)（Structure）

 

組分信息

組分名稱	60224ES03	60224ES10
規(guī)格	1 g (20 mL)	10×1g (20mL)

 

儲(chǔ)存條件

2~8℃保存，避免反復(fù)凍融。有效期2年。

 

使用說(shuō)明

1. 常用篩選濃度

潮霉素B用來(lái)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類型、培養(yǎng)基、生長(zhǎng)條件和細(xì)胞代謝率而變化，推薦使用濃度為50-1000 μg/mL。對(duì)于第一次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議建立殺滅曲線（kill curve），即劑量反應(yīng)性曲線，來(lái)確定最佳篩選濃度。

一般而言，哺乳動(dòng)物細(xì)胞50-500 μg/mL；細(xì)菌/植物細(xì)胞20-200 μg/mL；真菌300-1000 μg/mL。

2. 殺滅曲線的建立

為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素最低濃度，可通過(guò)建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線）來(lái)實(shí)現(xiàn)，至少選擇5個(gè)濃度。

1）第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO₂培養(yǎng)過(guò)夜?！咀ⅰ浚簩?duì)于需要更高密度來(lái)檢測(cè)活力的細(xì)胞，可增加接種量。

2）根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定50，100，250，500，750，1000 μg/mL。先用去離子水或者PBS buffer按照1:10的比例將母液稀釋到5 mg/mL，然后按照下表稀釋到相應(yīng)濃度的工作液。

終濃度（μg/mL）	培養(yǎng)基體積（mL）	5 mg/mL潮霉素B加入體積（mL）
50	9.9	0.1
100	9.8	0.2
250	9.5	0.5
500	9.0	1.0
750	8.5	1.5
1000	8.0	2.0b

3）第二天：替換舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。

4）接下來(lái)每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。

5）按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。

3. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選

1）轉(zhuǎn)染48 h后，用含有適當(dāng)濃度的潮霉素B篩選培養(yǎng)基來(lái)傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）?！咀ⅰ浚杭?xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果最好。則當(dāng)細(xì)胞過(guò)于稠密，其效率會(huì)降低。為了得到較好的篩選效果，最好將細(xì)胞稀釋至豐度不超過(guò)25%。

2）每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。

3）篩選7天后觀察并評(píng)估細(xì)胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這取決于宿主細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染，以及篩選效果。

4）挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

5）之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

 

注意事項(xiàng)

1. 潮霉素B的抗性基因（hyg或hph）除了來(lái)自E. Coli.外，還發(fā)現(xiàn)于其他的菌株，包括Streptomyces hygroscopicus和Klebsiella pneumoniae。

2. 本品為有毒化合物，避免與皮膚和眼睛接觸，請(qǐng)小心操作。

3. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

4. 本產(chǎn)品僅用于科研用途，禁止用于人身上。