植物細(xì)胞含細(xì)胞壁，采用BrdU抗體檢測方法通常需要消化植物細(xì)胞細(xì)胞壁，這易帶來一些雜質(zhì)干擾，甚至破壞重要的細(xì)胞形態(tài)表征，導(dǎo)致檢測的可靠性大大降低。EdU和Yefluor系列染料分子均很小能夠輕松地透過細(xì)胞壁屏障，因而無需消化細(xì)胞壁即可完成檢測。而且該方法無需DNA變性、抗原修復(fù)、抗原抗體反應(yīng)即可準(zhǔn)確地檢測植物生長，發(fā)育，分化等性狀的細(xì)胞增殖情況，使用更加方便、快速、靈敏。本試劑盒中EdU試劑含有炔烴，而Yefluor 488 Azide染料試劑含有疊氮化合物。采用點(diǎn)擊法的EdU標(biāo)記增殖快速有效，使用方便。

光譜特性：Yefluor 488 Azide：Ex/Em=495/519 nm；Hoechst 33342：Ex/Em=350/461 nm,bound to DNA。

產(chǎn)品組分

編號	組分名稱	產(chǎn)品編號/規(guī)格
		40287ES60（100T）	保存條件
40287-A	10 mM EdU	0.2 mL	-20℃
40287-B	Yefluor 488 Azide	20 μL	-20℃，避光
40287-C	10× Click-iT EdU 反應(yīng)緩沖液	1 mL	2-8℃
40287-D	CuSO4	0.5 mL	2-8℃
40287-E	Click-iT EdU 緩沖液添加物	30 mg	2-8℃
40287-F	Hoechst 33342	25 μL	2-8℃

注：上述反應(yīng)次數(shù)是針對96孔板培養(yǎng)的細(xì)胞計算。

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。-20℃避光保存，1年有效。

注意事項(xiàng)

1）操作時請采取防護(hù)措施，穿防護(hù)服、戴一次性手套等。
2）本產(chǎn)品僅作科研用途！

使用說明

1、EdU標(biāo)記細(xì)胞

1.1 按每孔4×103-1×105個細(xì)胞接種于96孔板中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計進(jìn)行所需要的藥物處理或者其他刺激處理。

1.2 準(zhǔn)備一份2×的EdU工作液（組分A）：以完全培養(yǎng)基稀釋10mM的儲液至合適的工作濃度。推薦以10 μM的初始工作濃度開始預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 預(yù)熱2×的EdU工作液，加入等體積的培養(yǎng)基使?jié)舛茸優(yōu)?×(如：需要得到10μM的終濃度，應(yīng)以新鮮培養(yǎng)基等體積加入到20μM的EdU工作液中)。

1.4 合適時間合適條件孵育細(xì)胞，EdU孵育細(xì)胞的時間可以直接用作測定細(xì)胞DNA合成的指標(biāo)，時間點(diǎn)選擇以及孵育時間的長度取決于細(xì)胞生長速率。通過短暫的EdU孵育進(jìn)行的脈沖式標(biāo)記細(xì)胞可以用于研究細(xì)胞周期動力學(xué)。

注意：EdU的標(biāo)記濃度應(yīng)根據(jù)所用的細(xì)胞類型做相應(yīng)的優(yōu)化選擇，推薦客戶以10μM的EdU初始濃度進(jìn)行摸索。細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞生長密度及細(xì)胞類型和其他實(shí)驗(yàn)條件都有可能影響細(xì)胞的標(biāo)記效果。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們建議客戶設(shè)置一系列的EdU濃度梯度，以確定最佳的合適您的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)濃度。

 

2、細(xì)胞固定及促滲操作

2.1 孵育完成后，去除培養(yǎng)基加入50μL 4%中性多聚甲醛至各個孔，室溫孵育15-30min后，去除固定液。

2.2 每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸溶液，室溫孵育5min，中和殘留的固定液。

2.3 按每孔0.1mL 3% BSA in PBS的洗滌液洗滌細(xì)胞2次。

2.4 去除洗滌液，加入0.1mL 0.5% Triton X-100 in PBS到每個孔中，室溫孵育20 min。

注意：本參考步驟是針對以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促滲操作樣本而優(yōu)化的操作方法，但本參考所介紹的步驟同樣可用于其他類似操作的樣本，如以甲醇固定以皂苷固定的樣本等。

 

3、EdU檢測

注意：本參考步驟每孔反應(yīng)使用100 μL的Click-iT反應(yīng)混合物。用戶可根據(jù)自己的樣本情況調(diào)整等比例減少所用的溶液體積。

3.1 準(zhǔn)備1×Click-iT EdU 反應(yīng)緩沖液（組分C）：10×組分C試劑以去離子水稀釋10倍即可。

3.2 制備一份5×的Click-iT EdU反應(yīng)添加物儲液（組分E）：加0.3mL去離子水至30 mg的E組分試管中（100mg/mL），混勻至全部溶解。使用后，剩余儲液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈現(xiàn)棕色，則說明有效成分降解不能再用（注意：不同規(guī)格的組分E均按照此比例加去離子水溶解為5×儲液備用）。

3.3 準(zhǔn)備1×Click-iT EdU緩沖液添加物：以去離子水稀釋5×儲液（組分E）至1×，溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，當(dāng)天用完。

3.4 依據(jù)表1.準(zhǔn)備Click-iT反應(yīng)混合物。表1.要求添加的組分對于反應(yīng)來說非常重要，否則反應(yīng)無法有效進(jìn)行。

表1 Click-iT反應(yīng)混合物

反應(yīng)組分	以10個孔的樣本數(shù)為例
1× Click-iT EdU 反應(yīng)緩沖液（組分C）	860 µL
CuSO4 （組分D）	40 µL
Yefluor 488 Azide（組分B）	2 µL
1× 反應(yīng)緩沖液添加物（步驟3.3所準(zhǔn)備）	100 µL
總體積	1 mL

3.5 去除促滲劑，以每孔0.1mL的3% BSA in PBS的洗滌液洗滌2次，去除洗滌液。

3.6 加入0.1mL Click-iT反應(yīng)混合物至每個孔，簡短搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋細(xì)胞。

3.7 室溫避光孵育30min。

3.8 去除反應(yīng)混合物，每孔以0.1mL 3% BSA in PBS洗滌兩次，去除洗滌液。

對于核染色，可以進(jìn)行DNA復(fù)染。如其他無特別要求，即可進(jìn)行拍照分析。

 

4、 DNA復(fù)染

4.1 按0.1 mL PBS洗滌每孔1次，去掉洗滌液。

4.2 以PBS稀釋Hoechst 33342（組分F）儲液1:2000至1× Hoechst 33342溶液，終濃度為5 μg/mL。

4.3 每孔加0.1 mL 1× Hoechst 33342溶液，室溫避光孵育15-30 min。除去Hoechst 33342溶液

4.4 0.1 mL PBS洗滌每孔2次，去除洗滌液

HB210526