細(xì)胞增殖檢測是評估細(xì)胞健康程度、遺傳毒性及抗腫瘤藥物效果的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)手段。常用的檢測細(xì)胞增殖方法是BrdU法。EdU法檢測是Brdu方法的升級(jí)和突破。EdU（5-溴-2-脫氧尿嘧啶）是一種嘧啶類似物，可在DNA合成期整合入DNA雙鏈。EdU法檢測是基于“點(diǎn)擊”反應(yīng)，一種由銅催化的疊氮化合物和炔烴的原子共價(jià)反應(yīng)。

試劑盒中EdU試劑含有炔烴，而Yefluor 647 Azide染料試劑含有疊氮化合物。點(diǎn)擊法的EdU標(biāo)記增殖快速有效，易于使用。只需少量的疊氮化染料即可有效地標(biāo)記出整合的EdU。標(biāo)準(zhǔn)化的戊二醛固定和去污劑促滲可以使檢測試劑進(jìn)入細(xì)胞，而Brdu方法則需要DNA變性（如酸變性、熱變性或者用DNase消化）去暴露BrdU從而方便BrdU抗體結(jié)合。

本試劑盒包含EdU法檢測所需要的所有組份，可以檢測細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期分析，適用于熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測。對于細(xì)胞周期的分析，試劑盒提供了細(xì)胞核染料Hoechst 33342。

 

產(chǎn)品信息

貨號(hào)	40277ES60 / 40277ES76
規(guī)格	100 T / 500 T（適用于熒光顯微鏡）；或10 T / 50 T（適用于流式細(xì)胞儀）
光譜特性	Yefluor 647 Azide：Ex/Em=650/670 nm；Hoechst 33342：Ex/Em=350/461nm, bound to DNA
適用設(shè)備	熒光顯微鏡；流式細(xì)胞儀

 

組分信息

組分編碼	組分名稱	40277ES60 (100 T / 10 T)	40277ES76 (500 T / 50 T)
40277-A	10 mM EdU	0.2 mL	1 mL
40277-B	Yefluor 647 Azide	50 µL	250 µL
40277-C	10× Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液	1 mL	5 mL
40277-D	CuSO4	0.5 mL	2×1.25 mL
40277-E	Click-iT EdU緩沖液添加物	30 mg	150 mg
40277-F	Hoechst 33342	25 µL	125 µL

 

儲(chǔ)存條件

-25~-15℃避光儲(chǔ)存，有效期1年。開封后，組分A（10 mM EdU）需-25~-15℃儲(chǔ)存，組分B（Yefluor 647 Azide）需-25 ~-15℃避光儲(chǔ)存，其余組分2-8 ℃存儲(chǔ)即可。

 

使用說明

熒光顯微鏡檢測方法

1.其他所需試劑

10 mM PBS, pH 7.2-7.6

中性多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛 in PBS ）

2 mg/ml 甘氨酸溶液（去離子水配制）

促滲試劑（0.5% Triton X-100 in PBS）

3% BSA in PBS, pH 7.2-7.6

去離子水

18×18 mm 蓋玻片

2. EdU標(biāo)記細(xì)胞

注意：EdU的標(biāo)記濃度應(yīng)根據(jù)所用的細(xì)胞類型做相應(yīng)的優(yōu)化選擇，推薦客戶以10 μM的EdU初始濃度進(jìn)行摸索。細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞生長密度及細(xì)胞類型和其他實(shí)驗(yàn)條件都有可能影響細(xì)胞的標(biāo)記效果。預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們建議客戶設(shè)置一系列的EdU濃度梯度，以確定最佳的合適您的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)濃度。

1）以每孔4×10³-1×10⁵細(xì)胞接種于96孔板中，進(jìn)行您所需要的藥物處理或者其他刺激處理。

2）準(zhǔn)備一份2×的EdU工作液（組分A）：以完全培養(yǎng)基稀釋10 mM的儲(chǔ)液至合適的工作濃度。建議您以10 μM的初始工作濃度開始預(yù)實(shí)驗(yàn)。

3）預(yù)熱2×的EdU工作液，加入等體積的培養(yǎng)基，使?jié)舛茸優(yōu)?×(如：需要得到10 μM的終濃度，應(yīng)以新鮮培養(yǎng)基等體積加入到20 μM的EdU工作液中)。

4）合適時(shí)間合適條件孵育細(xì)胞，EdU孵育細(xì)胞的時(shí)間可以直接用作測定細(xì)胞DNA合成的指標(biāo)，時(shí)間點(diǎn)選擇以及孵育時(shí)間的長度取決于細(xì)胞生長速率。通過短暫的EdU孵育進(jìn)行的脈沖式標(biāo)記細(xì)胞可以用于研究細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)。

3. 細(xì)胞固定及促滲操作

1）孵育完成后，去除培養(yǎng)基加入50 μL 4%中性多聚甲醛至各個(gè)孔，室溫孵育15-30 min后，去除固定液。

2）每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液，室溫孵育5 min，中和殘留的固定液。

3）以每孔0.1 mL 3% BSA in PBS的洗滌液洗滌細(xì)胞2次。

4）去除洗滌液，加入0.1 mL 0.5% Triton X-100 in PBS到每個(gè)孔中，室溫孵育20 min。

注意：本參考步驟是針對以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促滲操作樣本而優(yōu)化的操作方法，但本參考所介紹的步驟同樣可用于其他類似操作的樣本，如以甲醇固定以皂苷固定的樣本等。

4. EdU檢測

注意：本參考步驟每孔反應(yīng)使用100μL的Click-iT反應(yīng)混合物。用戶可根據(jù)自己的樣本情況調(diào)整等比例減少所用的溶液體積。

1）準(zhǔn)備1× Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液（組分C）：10×組分C試劑以去離子水稀釋10倍即可。

2）制備一份5×的Click-iT EdU反應(yīng)添加物儲(chǔ)液（組分E）：加0.3 mL去離子水至30 mg的E組分試管中（100 mg/mL），混勻至全部溶解。使用后，剩余儲(chǔ)液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈現(xiàn)棕色，則說明有效成分降解不能再用（注意：不同規(guī)格的組分E均按照此比例加去離子水溶解為5×儲(chǔ)液備用）。

3）準(zhǔn)備1× Click-iT EdU緩沖液添加物：以去離子水稀釋5×儲(chǔ)液（組分E）至1×，溶液應(yīng)新鮮配置，當(dāng)天用完。

4）依據(jù)表1準(zhǔn)備Click-iT反應(yīng)混合物。表1要求添加的組分對于反應(yīng)來說非常重要，否則反應(yīng)無法有效進(jìn)行。

表1.用于熒光顯微鏡檢測的Click-iT反應(yīng)混合物

組分名稱	以10個(gè)孔的樣本數(shù)為例
1× Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液（組分C）	855 µL
CuSO4 （組分D）	40 µL
Yefluor 647 Azide（組分B）	5 µL
1×反應(yīng)緩沖液添加物（步驟4.3所準(zhǔn)備）	100 µL
總體積	1 mL

5）去除促滲劑，以每孔0.1 mL的3% BSA in PBS的洗滌液洗滌2次，去除洗滌液。

6）加入0.1 mL Click-iT反應(yīng)混合物至每個(gè)孔，簡短搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋細(xì)胞。

7）室溫避光孵育30 min。

8）除去反應(yīng)混合物，每孔以0.1 mL 3% BSA in PBS洗滌兩次，去除洗滌液。

對于核染色，可以進(jìn)行DNA復(fù)染。如其他無特別要求，即可進(jìn)行拍照分析。

5. DNA復(fù)染（可選）

1）以0.1 mL PBS洗滌每孔1次，去掉洗滌液。

2）以PBS稀釋Hoechst 33342（組分F）儲(chǔ)液1:2000至1× Hoechst 33342溶液，終濃度為5 µg/mL。

3）每孔加0.1 mL 1× Hoechst 33342溶液，室溫避光孵育15-30 min。除去Hoechst 33342溶液。

4）0.1 mL PBS洗滌每孔2次，去除洗滌液。

流式細(xì)胞儀檢測方法

6.其他所需試劑

10 mM PBS, pH 7.2-7.6

中性多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛in PBS ）

促滲試劑（0.5% Triton X-100 in PBS）

1% BSA in PBS, pH 7.4

7.EdU標(biāo)記

注意：EdU的標(biāo)記濃度應(yīng)根據(jù)所用的細(xì)胞類型做相應(yīng)的優(yōu)化選擇，推薦客戶以10 µM的EdU初始濃度進(jìn)行摸索。細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞生長密度及細(xì)胞類型和其他實(shí)驗(yàn)條件都有可能影響細(xì)胞的標(biāo)記效果。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們建議客戶設(shè)置一系列的EdU濃度梯度，以確定最佳的合適您的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)濃度。

1）按每孔1×10⁵~3×10⁶個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至正常生長階段。進(jìn)行您所需要的藥物處理或者其他刺激處理。

2）EdU加入細(xì)胞培養(yǎng)基至所需的濃度混勻，推薦客戶以10 μM的EdU初始濃度進(jìn)行摸索。細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞生長密度及細(xì)胞類型和其他實(shí)驗(yàn)條件都有可能影響細(xì)胞的標(biāo)記效果。

3）以合適時(shí)間和條件孵育細(xì)胞，EdU孵育細(xì)胞的時(shí)間可以直接用作測定細(xì)胞DNA合成的指標(biāo)，時(shí)間點(diǎn)選擇以及孵育時(shí)間的長度取決于細(xì)胞生長速率。通過短暫的EdU孵育進(jìn)行的脈沖式標(biāo)記細(xì)胞可以用于研究細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)。

注意：EdU濃度與孵育時(shí)間相關(guān)，短時(shí)間孵育(< 2 h)宜采用高濃度，如：10~50 μM，長時(shí)間孵育( >24 h)宜采用低濃度，如：1~10 μM。

8. 細(xì)胞固定及促滲操作

1）孵育完成后，收集細(xì)胞，1% BSA in PBS清洗細(xì)胞1次，離心收集細(xì)胞。

2）100 µL 4%多聚甲醛in PBS重懸細(xì)胞。

3）室溫避光孵育15 min。

4）1% BSA in PBS的洗滌液洗滌細(xì)胞2次。

5）0.1 mL 0.5% Triton X-100促滲液重懸細(xì)胞，室溫孵育20 min。

注意: ①本參考步驟是針對以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促滲操作樣本而優(yōu)化的操作方法，但本參考所介紹的步驟同樣可用于其他類似操作的樣本，如以甲醇固定以皂苷固定的樣本等等。

②對于需要同時(shí)做細(xì)胞表面抗原標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)，可以考慮在完成EdU孵育后，以含1% BSA-PBS洗滌2次細(xì)胞后，在細(xì)胞固定促滲之前進(jìn)行。

9. EdU檢測

1）制備一份5×的Click-iT EdU反應(yīng)添加物儲(chǔ)液（組分E）：加1 mL去離子水至100 mg的E組分試管中（100 mg/mL），混勻至全部溶解。使用后，剩余儲(chǔ)液存放在≤ -20 ℃，可保存一年，溶液一旦呈現(xiàn)棕色，則說明有效成分降解不能再用（注意：不同規(guī)格的組分E均按照此比例加去離子水溶解為5×儲(chǔ)液備用）。

2）準(zhǔn)備1× Click-iT EdU緩沖液添加物：以去離子水稀釋5×儲(chǔ)液（組分E）至1×，溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，當(dāng)天用完。

3）準(zhǔn)備1× Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液: 10×Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液 (組分C) 以去離子水稀釋10倍即可。

4）依據(jù)表2準(zhǔn)備Click-iT反應(yīng)混合物。

注意：表2要求添加的組分對于反應(yīng)來說非常重要，否則反應(yīng)無法有效進(jìn)行。

表2. 用于流式細(xì)胞儀檢測的Click-iT反應(yīng)混合物

組分名稱	每單次反應(yīng)所需的加液體積
1× Click-iT EdU反應(yīng)緩沖液（步驟9.3所準(zhǔn)備）	875 µL
CuSO4 （組分D）	20 µL
Yefluor 647 Azide（組分B）	5µL
1×反應(yīng)緩沖液添加物（步驟9.2所準(zhǔn)備）	100 µL
總體積	1 mL

5）加入1 mL Click-iT反應(yīng)混合物至每管，混勻。

6）室溫避光孵育反應(yīng)混合物30 min。

7）以1% BSA in PBS洗滌細(xì)胞一次，收集細(xì)胞去除上清，以1 mL含1% BSA的PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

 

注意事項(xiàng)

1.為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2.本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

Ver.CN20230525