產(chǎn)品說明書
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COA
已發(fā)表文獻
產(chǎn)品描述
本產(chǎn)品是大腸桿菌重組表達來源的噬菌體T7 RNA聚合酶，以含有T7啟動子序列（5’-TAATACGACT CACTATAG*-3’）的雙鏈DNA為模板，以NTP為底物，合成與啟動子下游的反向單鏈DNA互補的RNA。雙鏈線性平末端或5’突出末端DNA均可作為T7 RNA聚合酶的底物模板，因此線性質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物均可用作體外合成RNA的模板。
注：G*為RNA轉(zhuǎn)錄的第一個堿基。
產(chǎn)品組分
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編號 |
組分 |
產(chǎn)品編號/規(guī)格 |
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10617ES92(10 KU) |
10617ES97(50 KU) |
10617ES98(500 KU) |
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10617-A |
T7 RNA polymerase (1 KU/μL) |
10 μL |
50 μL |
500 μL |
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10617-B |
10×Transcription Buffer |
100 μL |
500 μL |
1 mL×5 |
注：10×Transcription Buffer中含60 mM MgCl2和100 mM DTT，但不含有NTP，如需請購買本公司NTP set solution 10133。
產(chǎn)品應(yīng)用
1. 單鏈 RNA合成（包括mRNA，siRNA，gRNA等各類RNA前體，以及同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記的RNA探針）
2. 以（Cap analog）為引物合成Capped mRNA
酶活定義
在 37℃、pH8.0 的條件下，1小時內(nèi)使 1 nmol 的 [3H] GMP 摻入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定義為1個活性單位。
運輸儲存方法
干冰運輸。-20℃保存，有效期一年。
質(zhì)量控制
核酸外切酶殘留檢測：100 U 本品和 0.5 μg λDNA-Hind Ⅲ，37℃下孵育 4 h，DNA 的電泳譜帶無變化。
切口酶殘留檢測：100 U 本品和 0.5 μg IL23R 質(zhì)粒，37℃下孵育 4 h，DNA 的電泳譜帶無變化。
Rnase 殘留檢測：100 U 本品和 0.5 μg 293T 細胞總 RNA，37℃下孵育 4 h，RNA 的電泳譜帶無變化。
注意事項
1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
應(yīng)用實例
1、按下列體系配制反應(yīng)體系
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組分 |
體積（μL） |
終濃度 |
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10×Transcription Buffer (Mg2+ Plus) |
2 |
1× |
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CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each) |
0.4 each |
2 mM each |
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T7 RNA Polymerase (1 KU/μL) |
0.5-1 |
- |
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RNase inhibitor (40 U/μL) |
1 |
- |
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RNase free H2O |
Up to 18 |
- |
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模板DNA |
2 (100 ng-1μg) |
- |
【注】：
① DNA模板需要最后加入。由于10×Buffer中含有亞精胺，亞精胺濃度過高會引起DNA模板沉淀。
② Buffer和水建議放置到室溫，然后開始使用，反應(yīng)于室溫下配制，防止溫度低引起亞精胺沉淀高濃度DNA模板。
③ 若轉(zhuǎn)錄長度< 100 nt，模板投入量可增加至2μg。
④ RNase inhibitor (40 U/μL)請購買本公司產(chǎn)品10603。
⑤ 為了特定區(qū)域的有效轉(zhuǎn)錄，建議在其區(qū)域下游把模板DNA預(yù)先切成平端或5′突出末端。
2、37℃反應(yīng)1-2個小時（若轉(zhuǎn)錄長度≤ 100 nt，增加時間至4-8h）。
3、反應(yīng)結(jié)束后，使用2U DNaseⅠ（無RNase）37℃ 15分鐘去除DNA模板。
4、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化：體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可選用RNA Cleaner磁珠進行純化（12602），以去除蛋白、鹽離子和其他雜質(zhì)。也可以采用酚/氯仿純化法（具體操作步驟可聯(lián)系Yeasen索取）。
注意事項
1、DNA模板的種類：推薦使用含T7啟動子的線性化質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物作為模板。
2、轉(zhuǎn)錄模板的純度會顯著影響體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在質(zhì)粒DNA抽提過程中殘留的RNase A會顯著影響轉(zhuǎn)錄RNA的質(zhì)量。通過酚-氯仿抽提的質(zhì)粒DNA為最佳模板；PCR產(chǎn)物建議采用膠回收純化后使用。
3、在20 μL反應(yīng)體系中加入0.02U熱穩(wěn)定無機焦磷酸酶可顯著提高轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量。
HB210929
