超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。目前有多種SOD活性測定方法，其中NBT（氮藍四唑）法和WST法都是常用的檢測方法。

本試劑盒是一種基于NBT的顯色反應(yīng)，通過黃嘌呤(Xanthine)及黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XO)催化產(chǎn)生超氧陰離子(O2.-)，O2.-將氮藍四唑還原為藍色的甲臜(formazan)，甲臜(formazan)在560 nm處有強吸收。而超氧化物岐化酶（SOD）可以抑制上述反應(yīng)，從而抑制了甲臜的形成。反應(yīng)液藍色愈深，說明超氧化物歧化酶活性愈低，反之則酶活性愈高。通過分析甲臜產(chǎn)物OD值，可計算SOD酶活力。檢測原理圖如下：

 

本試劑盒可以檢測細胞或組織勻漿液上清、全血、紅細胞抽提物、血清等多種生物樣品中的SOD活性水平。按照試劑盒提供使用步驟操作，1個試劑盒可供100次檢測。適合用于高通量篩選研究。

 

產(chǎn)品優(yōu)勢

1）NBT法反應(yīng)產(chǎn)物是穩(wěn)定的水溶性產(chǎn)物；

2）NBT法可以通過檢測單個時間點的吸光值測定SOD活力；

3）NBT法測定時最大抑制百分率可以接近100%；

4）不受樣品中過氧化氫的干擾，本試劑盒通過添加適量過氧化氫酶等特殊方法，有效去除常規(guī)樣品中過氧化氫的干擾。

 

產(chǎn)品組分

組分編號	組分名稱	組分規(guī)格
50104-A	SOD Assay Buffer  SOD檢測緩沖液	70 mL
50104-B	NBT	100 µL
50104-C	Enzyme Solution  酶溶液	100 µL
50104-D	40×Initial Solution  40×反應(yīng)啟動液	60 µL

 

運輸和保存方法

冰袋運輸。 -20 ℃保存，有效期6個月。【注】：NBT溶液需避光保存。

 

注意事項

1）待測樣品可-70 ℃保存一個月，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致SOD部分失活；

2）細胞或組織等樣品制備時不能采用含有Triton X-100等去垢劑的溶液，會干擾檢測；

3）抗氧化物會對本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾，例如0.1 mM ascorbic acid，5 mM GSH都會使測定出來的吸光度顯著升高。如果設(shè)置了使用說明中的空白對照3，就可以消除樣品中的抗氧化物的干擾。

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

5）本產(chǎn)品僅作科研用途，禁止用于臨床診斷或治療，禁止用于人身上。

 

使用方法

1．樣品的制備

① 細胞樣品

1000-2000 g，4℃離心10 min收集細胞，用4℃或冰浴預(yù)冷的PBS（或生理鹽水）洗滌1-2次。用預(yù)冷的PBS在4℃或冰浴中進行勻漿沉淀（可以使用玻璃勻漿器或各類常見勻漿器，如電動勻漿器等）。隨后4℃離心，取上清液待測。

② 組織樣品

動物解剖前用生理鹽水（0.9% NaCl，含有0.16 mg/mL肝素鈉）灌流徹底清除紅細胞及血塊，取適量的組織樣品。用預(yù)冷的PBS在4℃或冰浴中對組織樣品進行勻漿處理（可以使用玻璃勻漿器或各類常見勻漿器，如電動勻漿器等）。 隨后4℃離心，取上清液待測。

③ 血漿或紅細胞樣品

用抗凝管收集血液，顛倒混勻。4℃，600 g離心10 min，移取上清至新的1 mL離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進行檢測。紅細胞樣品可以參考步驟①細胞樣品的制備方法，或其他不含Triton X-100等去垢劑的樣品制備方法。

【注】a. 上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：20201）測定蛋白濃度。通常10-20 µg蛋白的細胞        或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個活力單位左右(不同細胞和組織的差異會比較大，該活力范圍僅作參考)。每種樣品準(zhǔn)備20-100 µg蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測。

 b. 根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液適當(dāng)稀釋樣品。例如，小鼠肝臟組織10%勻漿液（組織和勻漿液的重量比為10%）上清，通常需要稀釋10-100倍。

 c. 準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測定，于-80℃凍存可保存至少1個月。但建議盡量當(dāng)天完成測定。注意反復(fù)凍融會導(dǎo)致SOD部分失活。

2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作

① NBT/酶工作液的配制：

按照每個反應(yīng)160 μL的體積配置適量的NBT/酶工作液。均勻混合158 μL SOD檢測緩沖液、1 μL NBT和1 μL酶溶液，即可配置成160 μL NBT//酶工作液。根據(jù)待檢測樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)品）的數(shù)量，配置適量的NBT/酶工作液。配制好的NBT/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。

【注】：由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后適當(dāng)混勻后再使用。

② 反應(yīng)啟動工作液的配制

把試劑盒中的反應(yīng)啟動液(40×) 融解后混勻，按照每1 μL反應(yīng)啟動液(40×)加入39 μL SOD檢測緩沖液的比例進行稀釋，混勻后即為反應(yīng)啟動工作液。根據(jù)待檢測樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)品）的數(shù)量，配置適量的反應(yīng)啟動工作液。配制好的反應(yīng)啟動工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。

③ （可選）SOD標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備

需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的稀釋液將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至以下系列濃度：200 U/mL，100 U/mL，50 U/mL，20 U/mL，10 U/mL，5 U/mL，2 U/mL。在隨后的檢測中可以各取20 µL，參考樣品進行檢測。

【注】：為避免稀釋后SOD酶活性的下降，SOD標(biāo)準(zhǔn)品需現(xiàn)配現(xiàn)用；本試劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可以使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考。

3. 樣品測定

① 參考下表使用96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對照孔。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液。加入反應(yīng)啟動工作液后充分混勻。

【注】：加入反應(yīng)啟動工作液后反應(yīng)即會開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動工作液的時間先后差異而導(dǎo)致的誤差。

	樣品	空白對照1	空白對照2	空白對照3*
待測樣品	20 µL	/	/	20 µL
SOD檢測緩沖液	/	20 µL	40 µL	20 µL
NBT/酶工作液	160 µL	160 µL	160 µL	160 µL
反應(yīng)啟動工作液	20 µL	20 µL	/	/

【*】：如果樣品有顏色或含有抗氧化物質(zhì)，則需設(shè)置空白對照3；如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物則沒有必要設(shè)置空白對照3。

② 37℃孵育30 min。 【注】：孵育25-35 min檢測出來的SOD活力無顯著差異，但為保證檢測結(jié)果的一致性，推薦孵育30 min。

③ 在560 nm測定吸光度，可以選擇600 nm（或者600 nm以上，如650 nm）作為參比波長，560 nm吸光度的值扣除參比波長的吸光度值即可作為實測讀數(shù)。
4. 樣品中總SOD活力的計算

① 抑制百分率的計算

參考如下計算公式計算抑制百分率：

抑制百分率＝[(A空白對照1－A空白對照2)－(A樣品－A空白對照3)]/(A空白對照1－A空白對照2)×100%

如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物，則A空白對照2 = A空白對照3，則可以把計算公式簡化為：

抑制百分率＝(A空白對照1－A樣品)/(A空白對照1－A空白對照2)×100%

【注】：盡量使樣品的抑制百分率在30%-70%范圍內(nèi)。如果計算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要把該樣品重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣品；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度較高的待測樣品。

 ② SOD酶活力單位的定義：在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(unit)。

【注】：SOD活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進行適當(dāng)換算。

 ③ SOD酶活力的計算

SOD酶活力的計算公式如下：

待測樣品中SOD酶活力單位＝檢測體系中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率) units

比如，當(dāng)抑制百分率為50%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝50% / (1－50%) units＝1 units；當(dāng)抑制百分率為60%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝60% / (1－60%) units＝1.5 units。

④ 如果樣品為細胞或組織的勻漿液，可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù)，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細胞抽提液，可以根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/g血紅蛋白或U/mg血紅蛋白。

其他SOD檢測參考方案

1.SOD酶活力計算的參考方案：可以先使用本試劑盒繪制SOD標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線，然后根據(jù)樣品檢測到的抑制百分率對比標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線計算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時不必使用本方案進行檢測和計算。

2.此外，本方案需確保標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力數(shù)據(jù)可靠，不會因為標(biāo)準(zhǔn)品的保存問題而導(dǎo)致實際酶活力下降。

3.SOD酶活力的動力學(xué)檢測：如果條件許可，使用本試劑盒時也可以使用動力學(xué)方法檢測SOD的酶活力。通常在【步驟3 ① 后可以37 ℃孵育同時在560 nm連續(xù)測定吸光度30 min。根據(jù)30 min內(nèi)的吸光度變化的斜率計算出抑制百分率：

抑制百分率＝[(斜率空白對照1－斜率空白對照2)－(斜率樣品－斜率空白對照3)]/(斜率空白對照1－斜率空白對照2)×100%

4.其余的計算方法同上述非動力學(xué)的計算方法。動力學(xué)方法的檢測和計算更加精確一些，但檢測起來相對要麻煩一些。

5.使用本試劑盒通常使用非動力學(xué)方法即可。

 

HB211214