產(chǎn)品描述

 

Hieff NGS^® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit for Illumina^®是用于Illumina^®測序平臺的RNA測序文庫構建試劑盒，包含RNA片段化試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑，常規(guī)和鏈特異性ds-cDNA合成試劑，以及文庫擴增試劑。可以銜接mRNA純化試劑盒或rRNA去除試劑盒構建測序文庫。二鏈合成模塊配有兩種Buffer，客戶可根據(jù)需要進行常規(guī)建庫或鏈特異性建庫。其中鏈特異性二鏈合成Buffer中將dTTP替換為dUTP，使cDNA第二鏈中摻入dUTP，而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無法擴增含尿嘧啶的DNA模板，實現(xiàn)鏈特異性。提供的所有試劑都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制和功能驗證，最大程度上保證了文庫構建的穩(wěn)定性和重復性。

 

產(chǎn)品組分

 

運輸與保存方法

 

干冰運輸。-20℃保存。有效期1年。

 

注意事項

 

一、關于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

4. 請使用無RNase污染的耗材，并對實驗區(qū)域定期進行清理，推薦使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

5. PCR產(chǎn)物因操作不當極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進而影響實驗結(jié)果準確性。推薦將PCR反應體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離；配備文庫構建專用移液器等設備；定時對各實驗區(qū)域進行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除噴霧），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。

6. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

二、關于接頭連接 (Adapter Ligation)

1. 本公司可提供長接頭 (Indexed Adapter)試劑盒和短接頭（也稱為小Y接頭、不完整接頭）試劑盒，客戶可根據(jù)實驗需求進行選擇。

目前有48種Indexed Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)；雙端 384 種 Index Primers: Hieff NGS^® RNA 384 CDI Primer for Illumina^® , Set 1~Set 2  (Cat#12414~Cat#12415)。

2. 我們建議選用高質(zhì)量的商業(yè)化接頭。如客戶使用自制接頭，請委托具有NGS引物合成經(jīng)驗的公司，并備注需進行嚴格的防污染控制。此外，進行接頭退火操作時，請在超凈臺完成。每次只操作一種接頭，防止交叉污染。

3. 使用接頭時，請?zhí)崆皩⒔宇^取出放在4°C或冰盒上解凍；在室溫操作時，實驗室溫度最好不要超過25°C，防止接頭解鏈。

4. 建庫過程中，接頭濃度過高或過低都會導致建庫成功率變低。本試劑盒操作方案中，所加入的接頭體積固定為5 μL，請根據(jù)初始的RNA投入量，參考表1對接頭進行稀釋。本公司接頭原始濃度均為15 μM，接頭稀釋液請選擇0.1×TE buffer，稀釋過的接頭可在4°C保存48小時。

表1 Input Total RNA量與接頭使用濃度推薦表

Input Total RNA	Adapter stock concentration
10 ng	1 μM
100 ng	1.5 μM
500 ng	3 μM
≥1 μg	5 μM

三、關于文庫擴增 (Library Amplification)

1. 本試劑盒中的文庫擴增組分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所組成，在第一代的基礎上，大大增強了擴增的均一性，即使是低拷貝的基因，也能進行無偏好性地擴增。

2. 如果您使用 Indexed Adapter（也稱為長接頭、大Y接頭），可使用本試劑盒提供的引物 Primer mix 進行擴增；如果使用的是“短接頭”或者叫“小Y接頭”，則需要使用 Index Primers 進行擴增，加上相應的 Index。

3. 文庫擴增步驟需要嚴格控制擴增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導致文庫產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多，又將導致文庫偏好性增加、重復度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒進行文庫擴增，Input Total RNA 量與相應擴增循環(huán)數(shù)的推薦。

4. 表2中推薦的循環(huán)數(shù)可滿足絕大多數(shù)建庫需求，若您的樣本質(zhì)量較差（如降解嚴重的FFPE樣本），可根據(jù)實際情況適當增加循環(huán)數(shù)。mRNA建庫時請?zhí)貏e注意，由于不同物種和組織所提取的 Total RNA中，mRNA的含量差異較大，實驗中需根據(jù)建庫起始量、物種類型及樣本處理情況適當調(diào)整擴增循環(huán)數(shù)。

表 2 Input Total RNA 量與擴增循環(huán)數(shù)推薦表*

Input Total RNA	Number of cycles
	Non-stranded	Stranded
10 ng	15	15
100 ng	14	14
500 ng	12	13
1 μg	11	12

【注】：*由于文庫產(chǎn)量不僅與投入量和擴增循環(huán)數(shù)相關，樣本質(zhì)量、片段化條件、分選條件等都會影響產(chǎn)量。建庫過程中請根據(jù)實際情況綜合考慮，選擇最合適的建庫條件。

四、DNA磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. 建庫過程中有多個步驟需要使用DNA純化磁珠，我們推薦使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進行DNA純化和分選。

2. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4. 轉(zhuǎn)移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。

5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

6. 產(chǎn)物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4°C可保存2天，-20°C可保存1個月。

五、關于文庫質(zhì)檢 (Library Quality Analysis)

1. 通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質(zhì)量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

4. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop®等。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。

六、自備材料 (Other Material)

1. mRNA富集試劑盒：Hieff NGS^® mRNA Isolation Master Kit (Yeasen Cat#12603)。 

2. rRNA去除試劑盒：Hieff NGS^® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)或其他rRNA去除試劑盒。

3. RNA純化磁珠： Hieff NGS^® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)或其他等效產(chǎn)品。

4. DNA純化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP Beads (A63880)或其他等效產(chǎn)品。

5. RNA質(zhì)控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效產(chǎn)品。

6. Adapters：含Index的長接頭 (Yeasen Cat#12615~12618)或者無Index的短接頭試劑盒 (Yeasen Cat#12414-12415)。

7. 文庫質(zhì)檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品；文庫定量試劑。

8. 其他材料：無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

 

建庫流程圖

 

 圖1 RNA建庫操作流程

 

使用方法

 

Part 1：目標RNA的富集和片段化

該步驟是建庫前的目標RNA制備，根據(jù)建庫需求可選擇Poly(A) mRNA Isolation方案（方案A）或rRNA Depletion方案（方案B）。Yeasen Cat#12252建庫模塊不包含該步驟所用試劑，請客戶根據(jù)建庫需要自備相應的試劑。

方案A：mRNA純化和片段化 (mRNA Purification and Fragmentation)

樣本要求

該方案使用Hieff NGS^® mRNA Isolation Master Kit (Yeasen Cat#12603)進行mRNA富集。適用于起始模板量為10 ng-4 μg（體積≤50 μL）的高質(zhì)量動物、植物和真菌等真核生物的總RNA。如初始RNA濃度偏低，體積超過50 μL，可使用Hieff NGS^® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)磁珠進行濃縮。RNA需通過Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片檢測，RIN值要求＞7，以保證mRNA有完整的poly(A)尾結(jié)構。本試劑盒的mRNA分離模塊使用的是oligo (dT)磁珠，只有帶poly(A)尾的mRNA才能被提??；其他不具poly(A)尾的RNA，如非編碼RNA、無poly(A)尾的mRNA等不能適用本試劑盒。此外，F(xiàn)FPE樣本中的mRNA降解嚴重，通常無完整的poly(A)尾結(jié)構，故亦無法使用本試劑盒進行建庫。

操作步驟

1. 將mRNA Capture Beads從2-8℃取出，靜置使其溫度平衡至室溫，約30 min。

2. 準備一個Nuclease free離心管，取10 ng-4 μg總RNA，用Nuclease Free水將體積補至50 μL，冰上放置備用。

3. 顛倒或旋渦振蕩混勻磁珠，吸取50 μL磁珠懸液加入至50 μL總RNA樣品中，用移液器吹打6次，使其充分混勻。

4. 將磁珠與RNA的混合物置于PCR儀中，65℃，5 min；25℃，5 min；25℃，hold，完成RNA與捕獲磁珠的結(jié)合。

5. 將樣品置于磁力架中，室溫靜置5 min，使mRNA與總RNA分離，小心移除上清。

6. 將樣品從磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠，移液器反復吹打6次以徹底混勻。將樣品置于磁力架中，室溫靜置5 min，小心移除上清。

7. 重復步驟6，共洗滌兩次。

8. 將樣品從磁力架上取出，加入50 μL Tris Buffer重懸磁珠，用移液器反復吹打6次以徹底混勻。

9. 將樣品置于PCR儀中，80℃，2 min；25℃，hold，將mRNA洗脫下來。

10. 將樣品從PCR儀中取出，加入50 μL Beads Binding Buffer，用移液器反復吹打6次以徹底混勻。

11. 室溫放置5 min，使mRNA結(jié)合到磁珠上。

12. 將樣品置于磁力架中，室溫靜置5 min，小心移除上清。

13. 將樣品從磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠，移液器反復吹打6次以徹底混勻，將樣品重新放回至磁力架中，室溫靜置5 min，吸掉全部上清。

【注】：最后需要用10 μL移液器吸干凈殘留液體。提前準備1× Frag/Prime Buffer（用Nuclease Free H₂O等體積混勻配置，如配置一個反應體系：9.5 μL 2×Frag/Prime Buffer + 9.5 μL Nuclease Free H₂O）

14. 將樣品從磁力架上取出，用19 μL Frag/Prime Buffer重懸磁珠，用移液器吹打6次以徹底混勻；將樣品置于PCR儀中（預設為94℃），可參考表3選擇片段化程序，但不同物種片段化的效果有差異，客戶可先根據(jù)自己的情況，做個片段化時間的梯度，比如94℃，5 min。使用Agilent 2100分析mRNA純化產(chǎn)物大小。

表3 mRNA片段化程序推薦

插入片段大小 (bp)	打斷程序
200-300	94°C, 10 min
300-400	94°C, 7 min
400-500	94°C, 5 min

15. 片段化程序結(jié)束后，為防止poly(A)尾RNA與磁珠結(jié)合，請立即將樣品置于磁力架中，待溶液澄清后，轉(zhuǎn)移17 μL上清至一個新的Nuclease Free離心管中，立刻進入第一鏈合成反應 (Part 2-Step 1)。

方案B：rRNA去除與RNA片段化 (rRNA Depletion and RNA Fragmentation)

樣本要求

該方案使用Hieff NGS^® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)去除Total RNA中的rRNA。適用于人、小鼠、大鼠來源的100 ng~1 μg （體積≤ 11 μL）總RNA樣品；適用于完整或部分降解RNA（如FFPE RNA）樣品。

操作步驟

Step 1 探針雜交

1. 將探針和雜交Buffer從-20 °C 取出，解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 準備RNA樣品：根據(jù)投入量和樣品濃度，計算RNA取樣體積，用Nuclease Free H₂O稀釋至11 μL。

3. 按照表4于200 μL PCR管中配制rRNA去除反應體系。

表4 探針雜交反應體系

名稱	體積 (μL)
Hybridization Buffer	3
Probe Mix(H/M/R)	1
Total RNA	11 (100 ng~1 μg)
Total	15

4. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應液離心至管底。

5. 將上述 PCR 管置于PCR儀（可設置梯度降溫）中，按照表5所示反應程序，進行探針雜交反應。

表5 探針雜交反應程序

溫度	時間
熱蓋105°C	On
95°C	2 min
95°C-22°C	0.1°C/s
22°C	5 min
4°C	hold

Step 2  RNase H消化

1.將RNase H消化試劑從-20 °C取出，解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。按照表 6 所示，配制RNase H消化反應體系。

表6 RNase H消化反應體系

名稱	體積 (μL)
RNase H Buffer	3
RNase H	2
上步產(chǎn)物	15
Total	20

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述 PCR 管置于PCR儀中，設置反應程序：熱蓋50℃；37°C，30 min；4°C，hold，進行RNase H消化反應。

Step 3  DNase I 消化

1. 將DNase I消化試劑從-20 °C 取出，解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。按照表7所示，配制DNase I消化反應體系。

表7 DNase I消化反應體系

名稱	體積 (μL)
DNase I Buffer	27.5
DNase I	2.5
上一步產(chǎn)物	20
Total	50

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述 PCR 管置于PCR儀中，設置反應程序：熱蓋50℃；37℃，30min； 4℃，hold，進行DNase I消化反應。

Step 4  RNA純化

1. 準備工作：將 Hieff NGS^® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少 30 min。用Nuclease Free H₂O配制 80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取 110 μL Hieff NGS^® RNA Cleaner (2.2×，Beads:DNA=2.2:1)至上一步產(chǎn)物中，移液器充分吹打混勻，室溫孵育 5 min。

4. 將PCR管置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H₂O新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec 后，小心移除上清。

6. 重復步驟 5，總計漂洗兩次。用 10 μL移液器吸干凈殘留液體。

7. 保持 PCR 管始終置于磁力架中，室溫下開蓋干燥磁珠 (5~10 min)。

【注】：提前準備1× Frag/Prime Buffer（用Nuclease Free H₂O等體積混勻配置，如配置一個反應體系：9.5 μL 2×Frag/Prime Buffer + 9.5 μL Nuclease Free H₂O）

8. RNA洗脫：將PCR 管從磁力架上取下，加入19 μL Frag/Prime buffer，使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置 5 min。

9. 將 PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取 17 μL 上清至新的Nuclease free PCR 管中，進行RNA片段化。

10. RNA片段化條件需根據(jù)樣本質(zhì)量進行調(diào)整，高質(zhì)量的RNA樣本，片段化條件可參考mRNA片段化條件（表3）。表8推薦了FFPE不同質(zhì)量樣本的片段化條件。但不同的樣本片段化效果會存在一定的差異，客戶可根據(jù)自己的樣本情況，做不同片段化條件對比，選擇合適的片段化條件。

11. 片段化結(jié)束請立即置于冰上，進入一鏈合成反應（Part 2-Step 1)。

表8  FFPE RNA片段化條件推薦

DV200*	片段化程序
>70%	94°C, 7 min
50%~70%	94°C, 5 min
20%~50%	85°C, 8 min
<20%（風險建庫）	65°C, 8 min

*降解RNA的樣本質(zhì)量使用DV₂₀₀指標判斷，詳見附錄三說明

Part 2：RNA文庫構建

Step 1 第一鏈cDNA的合成 (1^st Strand Synthesis)

該步驟將已經(jīng)富集/片段化的目標RNA合成一鏈cDNA。目標RNA的富集可根據(jù)實驗需求和樣本情況選擇Poly(A) mRNA isolation方案或rRNA Depletion方案，詳見Part 1。

1. 將第一鏈合成試劑從-20°C取出，顛倒混勻后瞬離。按表9所示，配制第一鏈cDNA合成的反應液。

表9 第一鏈cDNA合成反應體系

名稱	體積 (μL)
Frag/Prime Buffer with Fragmented RNA	17
Strand Specificity Reagent	6
1st Strand Enzyme Mix	2
Total	25

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表10所示設置反應程序，進行第一鏈cDNA的合成。反應結(jié)束后立即進行第二鏈cDNA的合成。

 

表10 第一鏈cDNA合成反應程序

溫度	時間
熱蓋 105°C	On
25°C	10 min
42°C	15 min
70°C	15 min
4°C	Hold

Step 2第二鏈cDNA的合成/末端修復/加A (2^nd Strand Synthesis/dA-Tailing)：

1. 將第二鏈合成試劑從-20 °C取出，解凍后顛倒混勻；按照表11所示，配制第二鏈cDNA合成/末端修復/加A反應液。

表11 第二鏈cDNA合成反應體系

名稱	體積 (μL)
1st Strand cDNA	25
2nd Strand Buffer ( dNTP or dUTP)*	30
2nd Strand Enzyme Master Mix	5
Total	60

【注】：*如構建普通mRNA文庫，請使用含dNTP的Buffer；如構建鏈特異性mRNA文庫，請使用含dUTP的Buffer。

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表12所示設置反應程序，進行第二鏈cDNA的合成。

表12 第二鏈cDNA合成反應程序

溫度	時間
熱蓋 105°C	on
16°C	30 min
72°C	15 min
4°C	Hold

Step 3 接頭連接 (Adapter Ligation)

該步驟可在末端修復和dA尾添加的產(chǎn)物末端，連接特定的Illumina^®接頭。

1. 參考注意事項二中的表1，根據(jù)Input RNA量，稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表13中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.3步驟結(jié)束后的PCR管中繼續(xù)配制表13所示反應體系。

表13 Adapter Ligation體系

名稱	體積 (μL)
dA-tailed DNA	60
Ligation Enhancer	30*
Novel T4 DNA Ligase	5
DNA Adapter	5**
Total	100

【注】：

*Ligation Enhancer使用前請上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時離心后使用。

**本公司接頭原始濃度為15 μM, 請根據(jù)注意事項二表1的提示，根據(jù)投入量對接頭進行稀釋，使接頭添加體積固定為5 μL。

4. 使用移液器輕輕吹打混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設置表14所示反應程序，進行接頭連接反應：

表14 Adapter Ligation反應程序

溫度	時間
熱蓋	Off
20°C	15 min
4°C	Hold

Step 4連接產(chǎn)物純化 (Post Ligation Clean Up)

本方案適用于片段＜200 bp時，通過兩次純化去除體系中的接頭殘留；當插入片段≥200 bp時，參照附錄二的分選方案，通過純化、分選獲得目標長度的文庫。

適用于插入片段<200 bp的文庫（需進行兩輪純化）

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入52 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取50 μL上清至新PCR管中，再進行一輪純化。

9. 吸取40 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads (0.8×，Beads:DNA=0.8:1)至上一步產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

10. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約3 min），小心移除上清。

11. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

12. 重復步驟11，總計漂洗兩次。

13. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

14. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，進行PCR擴增。

Step 5 文庫擴增 (Library Amplification)

該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產(chǎn)物進行PCR擴增富集。

1. 將表15中的試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表15所示反應體系。

【注】：*如果使用的是無Index的接頭，俗稱短接頭（小Y接頭），請使用短接頭試劑 (Cat#12414-12415)中配備的Index primer進行擴增。**如果您使用的是Indexed Adapter (Cat#12615~ Cat#12618)，俗稱長接頭（大Y接頭），可用試劑盒中的Primer Mix進行擴增；

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設置表16示反應程序，進行PCR擴增。

表16  PCR擴增反應程序

溫度	時間	循環(huán)數(shù)
98°C	1 min	1
98°C	10 sec	11~15cycles*
60°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	5 min	1
4°C	Hold	-

Step 6 擴增產(chǎn)物磁珠純化 (Post Amplification Clean Up)

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，進行文庫定量、質(zhì)檢。

Step 7 文庫質(zhì)量控制

通常情況下，構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質(zhì)量評價，具體請參見注意事項五。

附錄一：mRNA片段化效果展示

 

圖2. mRNA不同打斷時間對應的RNA片段范圍。分別以94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min處理。打斷后mRNA進行進行2.2X 磁珠純化，通過Agilent 2100 Bioanalyzer進行檢測。

【注】：本結(jié)果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA，若使用其他來源的RNA，最好優(yōu)化打斷時間。

附錄二：分選條件說明

分選方案適用于94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化的RNA建庫，可以獲得插入片段大于200bp的文庫：

方案一：接頭連接產(chǎn)物純化后分選

0.6X Hieff NGS^® DNA Selection Beads接頭連接產(chǎn)物的純化

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入102 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，準備進行雙輪分選。

雙輪分選（以94°C，7min打斷，分選文庫大小為410bp~510bp為例說明，其他文庫大小按推薦比例進行磁珠分選）

當選擇短接頭（小Y接頭）進行連接后純化，使用雙端384種 Index Primers: Hieff NGS^® RNA 384 CDI Primer Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2  (Cat#12414~Cat#12415)進行RNA建庫時，分選比例參照表17進行，當選擇長接頭（大Y接頭），使用Indexed Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)進行連接后純化，分選比例參照表18進行。

1. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

2. 根據(jù)DNA片段長度要求，參考表17，在上述100 μL DNA中加入第一輪分選磁珠65 μL (0.65×)，渦旋或移液器吹打10次混勻。

【注】：此表推薦的雙輪分選比例適用于Hieff NGS^® DNA Selection Beads；表中“×”表示樣品DNA體積。如所需文庫插入片段主峰為300 bp時，若在短接頭連接之后分選，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.65×100 μL=65 μL，第二輪分選磁珠使用體積為0.15×100 μL=15 μL；若在長接頭連接之后分選，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.65×100 μL=65 μL，第二輪分選磁珠使用體積為0.15×100 μL=15 μL。

3. 室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中，殘留1-2 μL溶液管底。

5. 參考表17向上清中加入第二輪分選磁珠15 μL (0.15×)。

6. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

7. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約3 min），小心移除上清。

8. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

9. 重復步驟8。

10. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約3 min）。

11. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

12. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約3 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈管中。

表17 短接頭文庫分選推薦磁珠比例

插入片段長度 (bp)	200~300	250~350	350~450	450~550
文庫長度 (bp)	260~360	310~410	410~510	510~610
打斷條件	94℃ 10min	94℃ 7min	94℃ 7min	94℃ 5min
第一輪磁珠體積(μL)	80 (0.8×)	75 (0.75×)	65 (0.65×)	60 (0.6×)
第二輪磁珠體積 (μL)	15 (0.15×)	15 (0.15×)	15 (0.15×)	10 (0.1×)

 

表18 長接頭文庫分選推薦磁珠比例

 

插入片段長度 (bp)	200~300	250~350	350~450	450~550
文庫長度 (bp)	320~420	370~470	470~570	570~670
打斷條件	94℃ 10min	94℃ 7min	94℃ 7min	94℃ 5min
第一輪磁珠體積(μL)	75 (0.75×)	70 (0.7×)	65 (0.65×)	60 (0.6×)
第二輪磁珠體積 (μL)	15 (0.15×)	15 (0.15×)	15 (0.15×)	10 (0.1×)

 

圖3. 1ug 293 total RNA，在94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化后，根據(jù)表17推薦的磁珠比例得到的文庫大小。

方案二：接頭連接產(chǎn)物直接分選（以94°C，7min打斷，分選文庫大小為410bp~510bp為例說明，其他文庫大小按推薦比例進行磁珠分選）

500 ng以上的總RNA做mRNA抓取后建庫，推薦直接分選，體系比較粘稠，需要小心添加，RNA質(zhì)量略差樣本可能會有接頭殘留。

當選擇短接頭（小Y接頭）進行連接后純化，使用雙端384種 Index Primers: Hieff NGS^® RNA 384 CDI Primer Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2  (Cat#12414-12415)進行RNA建庫時，分選比例參照表19進行，當選擇長接頭（大Y接頭），使用Indexed Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)進行連接后純化，分選比例參照表20進行。

1. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

2. 根據(jù)DNA片段長度要求，參考表19，在上述100 μL的連接體系中加入第一輪分選磁珠20 μL (0.20×)，渦旋或移液器吹打10次混勻。室溫孵育10 min。

3. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移 100 μL上清到干凈的離心管中，。

4. 參考表19向上清中加入第二輪分選磁珠10 μL (0.10×)。

5. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置10 min。

6. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約3 min），小心移除上清。

7. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

8. 重復步驟7。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約3 min）。

10. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

11. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約3 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈管中。

 

表19 短接頭文庫分選推薦磁珠比例

插入片段長度 (bp）	200~300	250~350	350~450	450~550
文庫長度 (bp)	260~360	310~410	410~510	510~610
打斷條件	94℃ 10min	94℃ 7min	94℃ 7min	94℃ 5min
第一輪磁珠體積(μL)	25 (0.25×)	25 (0.25×)	20 (0.2×)	18 (0.18×)
第二輪磁珠體積 (μL)	10 (0.1×)	10 (0.1×)	10 (0.1×)	10 (0.1×)

 

表20 長接頭文庫分選推薦磁珠比例

插入片段長度 (bp)	200~300	250~350	350~450	450~550
文庫長度 (bp)	320~420	370~470	470~570	570~670
打斷條件	94℃ 10min	94℃ 7min	94℃ 7min	94℃ 5min
第一輪磁珠體積(μL)	25 (0.25×)	20 (0.2×)	18 (0.18×)	18 (0.18×)
第二輪磁珠體積 (μL)	10 (0.1×)	10 (0.1×)	10 (0.1×)	10 (0.1×)

 

圖4. 1ug 293 total RNA，在94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化后，根據(jù)表19推薦的磁珠比例得到的文庫大小。

附錄二：FFPE樣本建庫說明

1. FFPE RNA質(zhì)量評價

rRNA去除建庫方案可用于FFPE等低質(zhì)量的 Total RNA 樣本，但由于不同F(xiàn)FPE樣本的質(zhì)量差距較大，需要根據(jù)樣本情況調(diào)整建庫條件。常規(guī)評價 RNA 樣本質(zhì)量的參數(shù)是 RIN 值，但是對于 FFPE 這種降解的樣本，并不能完全用 RIN 值來準確衡量樣本的質(zhì)量，此時還需要用到 DV₂₀₀指標。DV₂₀₀ 表示樣本中大于 200nt的 RNA 片段所占的比例，對于降解嚴重的 FFPE 樣本，DV₂₀₀值能夠更好的反應樣本的質(zhì)量。

DV₂₀₀計算方法如下：

 

① 在一個檢測完成的 Agilent 2100 Bioanalyzer 結(jié)果圖中，在 Local 下選擇 Advanced

② 勾選 Smear Analysis 下的 Perform Smear Analysis 選項

③ 選擇Region Table頁面，鼠標右擊，選擇Add Region

④ 調(diào)整指示線的范圍即可得到所選片段范圍 所占的比例 % of Total

2. FFPE RNA建庫示例

下表展示了不同質(zhì)量FFPE樣本在不同建庫條件下的文庫分布，以供參考。對于降解嚴重的FFPE RNA (DV₂₀₀<50%)和起始量低的文庫構建，我們推薦接頭連接后采用兩次純化方案，以減少文庫損失。

 

RNA樣本質(zhì)控	建庫條件	文庫分布質(zhì)控
RIN=2.2; DV200=74%         RIN=2.2; DV200=74%	投入量：500 ng 片段化條件：94℃，7 min 接頭連接后進行兩次純化：0.6×；0.8× 鏈特異建庫擴增：12cycles 文庫產(chǎn)量：717.2 ng
	投入量：500 ng 片段化條件：94℃，7min 接頭連接后進行純化/分選：0.6×；07×/0.15× 鏈特異建庫擴增：13cycles 文庫產(chǎn)量：437.8 ng
	投入量：100 ng 片段化條件：94℃，7 min 接頭連接后進行兩次純化：0.6×；0.8× 鏈特異建庫擴增：15cycles 文庫產(chǎn)量： 206.8ng
RIN=2.5; DV200=26%	投入量：500 ng 片段化條件：85℃，8 min 接頭連接后進行兩次純化：0.6×；0.8× 鏈特異建庫擴增：12cycles 文庫產(chǎn)量：207 ng
	投入量：500 ng 片段化條件：85℃，8 min 接頭連接后進行純化、分選：0.6×；0.70×/0.15× 鏈特異建庫擴增：13cycles 文庫產(chǎn)量：98.56 ng
RIN=2.5; DV200=11%	投入量：500 ng 片段化條件：65℃，8 min 接頭連接后進行兩次純化：0.6×；0.8× 鏈特異建庫擴增：12cycles 文庫產(chǎn)量：354.2 ng
	投入量：500 ng 片段化條件：65℃，8 min 接頭連接后進行兩次純化：0.6×；0.70×/0.15× 鏈特異建庫擴增：13cycles 文庫產(chǎn)量：172.48 ng

HB211206