Hieff NGS^® OnePot Pro DNA Library Prep Kit for Illumina^®是針對Illumina^®高通量測序平臺專業(yè)開發(fā)設計的新一代酶切法建庫試劑盒。與傳統(tǒng)的建庫法比較，本品采用高質(zhì)量的片段化酶，擺脫了繁瑣的超聲過程，同時簡化了操作流程，將片段化模塊與末端修復模塊合二為一，極大的降低了建庫的時間和成本。本試劑盒具有優(yōu)秀的文庫轉(zhuǎn)化率，可應用于常規(guī)動植物基因組、微生物基因組等樣本，同時能兼容FFPE DNA樣本的建庫。改進版試劑盒使用了優(yōu)化的連接酶，改善了接頭連接時的片段自連。同時，替換了新型高保真酶，進一步提升了擴增的均一性和保真性。

適用500 pg - 1 μg的基因組DNA、全長cDNA等樣本

高質(zhì)量片段化酶，可隨機切割雙鏈DNA，酶切片段無偏好性

片段化、末端修復/加A一步完成

強擴增效率的高保真酶，顯著提高文庫質(zhì)量及產(chǎn)量

適用于FFPE DNA樣本

嚴格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控

 

產(chǎn)品組分

組分編號與名稱		12205ES08	12205ES24	12205ES96
12205-A	Smearase® Buffer	80 μL	240 μL	960 μL
12205-B	Smearase® Enzyme	40 μL	120 μL	480 μL
12205-C	Ligation Enhancer	240 μL	720 μL	3×960 μL
12205-D	Novel T4 DNA Ligase	40 μL	120 μL	480 μL
12205-E	Canace® Pro Amplification Mix	200 μL	600 μL	4×600 μL
12205-F	Primer Mix	40 μL	120 μL	480 μL

 

運輸與保存方法

冰袋運輸。所有組分-20 °C保存，有效期1年。

 

注意事項

一、關于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進而影響實驗結(jié)果準確性。推薦將PCR反應體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離；使用專用的移液器等設備；并定時對各實驗區(qū)域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。

7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

二、關于DNA片段化

1. 本試劑盒兼容范圍為500 pg - 1 μg Input DNA。應盡可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。

2. 若Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會影響后續(xù)實驗，建議將DNA稀釋在TE (10 mM Tris-HCl ,1 mM EDTA，pH 8.0)中進行片段化。

3. 對于常規(guī)的高質(zhì)量基因組DNA，酶切時間參考表5，本試劑盒片段化偏好低，耐受各種GC含量的模板。對于不同降解程度的FFPE樣本，酶切時間參考表6。以上為推薦時間，需客戶在自己的實驗體系中進行微調(diào)，以達到最佳效果。

4. 為保證優(yōu)質(zhì)精確的片段化效果，片段化反應配制過程請于冰上操作。

5. 針對FFPE DNA建庫，若樣本質(zhì)量不佳，客戶對當前建庫產(chǎn)量不滿意，可選購我公司的FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606)對FFPE DNA進行修復，具體使用方法可參考此產(chǎn)品說明書。該試劑可與片段化末修加A過程同時進行，無需額外的操作。

三、關于接頭連接 (Adapter Ligation)

1. 針對Illumina®測序平臺，Yeasen提供48種Barcoded Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®，Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)；單端96種 Index Primers: Hieff NGS® 96 Single Index Primers Kit for Illumina®，Set 1~Set 2  (Cat#12611~Cat#12612)；雙端384種CDI Primers：Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina®，Set 1~Set 2 (Cat#12412~Cat#12413)；雙端384種UDI Primers: Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®， (Cat#12404~Cat#12407)。

2. Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產(chǎn)量。Adapter用量過高可能會產(chǎn)生較多Adapter Dimer；用量較低可能會影響連接效率及文庫產(chǎn)量。表1列舉了使用本試劑盒，不同Input DNA量推薦的Adapter使用量。

表1  500 pg-1 μg Input DNA推薦的Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter : Input DNA摩爾比	Input DNA	Adapter : Input DNA摩爾比
1 μg	10:1	50 ng	100:1
500 ng	20:1	25 ng	200:1
250 ng	40:1	1 ng	200:1
100 ng	100:1	500 pg	400:1

【注】：Input DNA摩爾數(shù) (pmol)≈ Input DNA質(zhì)量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度 (bp)]。

四、關于磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. DNA片段長度分選步驟可選擇在末端修復/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫擴增后進行。

2. 當Input DNA質(zhì)量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質(zhì)量<50 ng，建議您在文庫擴增后進行分選。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會對雙輪分選產(chǎn)生顯著影響。因此，如在接頭連接后進行長度分選，必須先進行純化步驟，再進行雙輪分選步驟；如在末端修復/dA尾添加之前或文庫擴增后進行長度分選，可直接進行雙輪磁珠分選步驟。

4. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

6. 轉(zhuǎn)移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

8. 進行長度分選時，初始樣品體積應盡量≥100 μL，不足時請用超純水補齊。以防因樣品體積太小導致移液誤差增大。

9. 產(chǎn)物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

10. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于4 °C可保存1-2周，-20 °C可保存1個月。

五、關于文庫擴增 (Library Amplification)

文庫擴增步驟需要嚴格控制擴增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導致文庫產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多，又將導致文庫偏好性增加、重復度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒，獲得1 μg文庫的推薦循環(huán)數(shù)。

表2  500 pg-1 μg Input DNA獲得1 μg產(chǎn)物擴增循環(huán)數(shù)推薦表

Input DNA (ng)	Number of cycles required to generate(1000 ng)
1000	2-4
500	3-5
250	4-6
100	5-7
50	7-8
10	9-11
5	10-12
1	12-14
0.5	13-15

注：上表為使用高質(zhì)量的Human gDNA構(gòu)建文庫使用的循環(huán)數(shù)參數(shù)。當DNA質(zhì)量較差或需要進行長度分選，則參照較高循環(huán)數(shù)進行文庫擴增。

六、關于文庫質(zhì)檢 (Library Quality Analysis)

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質(zhì)量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop®等。

4. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit®、PicoGreen®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫干擾。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。

 

使用方法

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。

3. DNA Adapter： 針對Illumina®測序平臺，Yeasen提供48種Barcoded Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)；單端96種Index Primers: Hieff NGS® 96 Single Index Primers Kit for Illumina®, Set 1~Set 2  (Cat#12611~Cat#12612)；雙端384種CDI Primers：Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina®，Set 1~Set 2 (Cat#12412~Cat#12413)；雙端384種UDI Primers: Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina® (Cat#12404~Cat#12407)。或其他等效產(chǎn)品。

4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer (10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA ，pH 8.0)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。
二、操作流程

圖1 OnePot Pro DNA建庫試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1 DNA片段化/末端修復/dA尾添加 (DNA Fragmentation/End Repair/dA-Tailing)

該步驟將基因組DNA片段化，同時進行末端修復及dA尾添加。

1. 將表3中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于冰上配制表3反應體系。

表3  DNA片段化/末端修復/dA尾添加 PCR反應體系

名稱	體積 (μL)
Input DNA	x
Smearase® Buffer	10
Smearase® Enzyme	5
TE	Up to 60

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設置表4所示反應程序，進行DNA片段化，末端修復及dA尾添加反應。

表4  DNA片段化/末端修復/dA尾添加 PCR反應程序

溫度	時間
熱蓋105 °C	On
4 °C	1 min*
30 °C	3-20 min**
65 °C	20 min
4 °C	Hold

【注】：*DNA片段化過程為有效控制片段化效果，避免過度酶切，反應程序可預先設置4 °C，待模塊溫度降至4 °C時，將PCR管放入PCR儀。

**對于完整的基因組DNA，酶切時間參考表5，Input DNA 500-1000 ng，可根據(jù)需求，適當延長酶切時間2-4 min左右；對于質(zhì)量不一的FFPE DNA樣本，酶切時間參考表6。

表5  常規(guī)基因組DNA片段化時間選擇表

插入片段主峰大小	片段化時間	優(yōu)化范圍
600 bp	8 min	6-12 min
350 bp	10 min	8-14 min
250 bp	12 min	10-15 min
200 bp	15 min	13-18 min
150 bp	20 min	15-25 min

表6  FFPE DNA片段化時間選擇表

插入片段主峰大小	片段化時間	DIN*
250 bp	9-13 min	> 8.0
	8-11 min	6.5-8.0
	4-8 min	4.2-6.5
	3-6 min	2.5-4.2

【注】：*DIN為DNA Integrity Number，是用Agilent 2200來定義FFPE DNA降解程度的一種方法，詳見圖2。

 

圖2  Agilent 2200定義不同降解程度樣本的DIN值

3.2 接頭連接 (Adapter Ligation)

該步驟將3.1步驟的產(chǎn)物末端，連接特定的Illumina®接頭。

1. 根據(jù)Input DNA量按表1稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表7中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.1步驟PCR管中配制表7所示反應體系。

表7  Adapter Ligation PCR體系

名稱	體積 (μL)
dA-tailed DNA（3.1步驟產(chǎn)物）	60
Ligation Enhancer	30*
DNA Adapter	5**
Novel T4 DNA Ligase	5

【注】：*Ligation Enhancer比較粘稠，請上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時后離心使用。

**本公司接頭濃度與常規(guī)商業(yè)化試劑盒一致，皆為15 μM。請根據(jù)注意事項三中的提示，對接頭進行稀釋，加水補齊，使接頭體積為5 μL。

【接頭添加計算舉例】：當Input DNA為100 ng，Input DNA長度為300 bp時，接頭應該添加多少？

第一步：計算Input DNA摩爾數(shù)。公式：Input DNA摩爾數(shù) (pmol)≈ Input DNA質(zhì)量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度 (bp)]；

Input DNA摩爾數(shù) (pmol)=100÷ (0.66×300)=0.5 pmol；

第二步：計算接頭添加摩爾數(shù)。根據(jù)注意事項三表1查詢接頭添加比例；

根據(jù)表1，查得Input DNA 100 ng時接頭添加比例100:1，則接頭添加摩爾數(shù)=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步：計算接頭添加體積。接頭濃度=15 μmol/L（如使用其他接頭，濃度需要依據(jù)其他接頭濃度參數(shù)）；

接頭添加體積=接頭添加摩爾數(shù) (50 pmol)÷接頭濃度 (15 μmol/L)=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL)

綜上，接頭可添加3.4 μL，加1.6 μL水補齊至5 μL。（注：接頭最大加入體積不超過5 μL）。

4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設置表8所示反應程序，進行接頭連接反應。

表8  Adapter Ligation PCR反應程序

溫度	時間
熱蓋	Off
20 °C	15 min
4 °C	Hold

【注】：當Input DNA量較低，實驗效果不理想時，可嘗試將連接時間延長一倍。

3.3 連接產(chǎn)物磁珠純化 (Post Ligation Clean Up)

該步驟使用磁珠對3.2步驟的產(chǎn)物進行純化或分選。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無效產(chǎn)物。

3.3.1 純化操作步驟

1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。最后使用10 μL小槍頭吸去殘余液體。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，進行洗脫：

1) 如產(chǎn)物無需進行片段分選，直接加入21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。【注：如純化產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。

2) 將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

3) 如產(chǎn)物需進行雙輪分選，加入102 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。

【注：如純化產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。

4) 將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

3.3.2 雙輪分選操作步驟：

1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡約30 min。配制80%乙醇。

2. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

3. 根據(jù)DNA片段長度要求，參考表9向上述100 μL DNA上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻。

表9  磁珠文庫分選推薦比例

DNA文庫插入片段大小	150-250 bp	200-300 bp	300-400 bp	400-500 bp	500-600 bp
DNA文庫大小	250-350 bp	350-450 bp	450-550 bp	550-650 bp	650-750 bp
第一輪體積比 (Beads:DNA)	0.80×	0.70×	0.60×	0.55×	0.50×
第二輪體積比 (Beads:DNA)	0.20×	0.20×	0.20×	0.15×	0.15×

【注】：表中“×”表示樣品DNA體積。如文庫插入片段長度為250 bp，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.70×100 μL=70 μL；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL；表中所推薦比例是針對于Adapter Ligated Insert DNA (Post Ligation)，如果用戶在接頭連接前進行分選，請采用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Cat#12601)說明書中推薦的比例。

4. 室溫孵育5 min。

5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中。

6. 參考表7向上清中加入第二輪分選磁珠。

7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重復步驟9，總計漂洗兩次。最后使用10 μL小槍頭吸去殘余液體。

11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中。

3.4 文庫擴增 (Library Amplification)

該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產(chǎn)物進行PCR擴增富集。

1. 將表10中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表10所示反應體系。

表10  PCR擴增反應體系

名稱	體積 (μL)
Adapter Ligated DNA（3.3步驟產(chǎn)物）	20
Canace® Pro Amplification Mix	25
Primer mix*	5

【注】：*如果使用的是完整接頭（Cat#12615~ Cat#12618），使用試劑盒中的Primer Mix進行擴增；如果使用了不完整的接頭（Cat#12611~Cat#12612、Cat#12412~Cat#12413、Cat#12404~Cat#12407），請參照上述試劑盒說明書，使用其中配備的Index Primer進行擴增。

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設置表11所示反應程序，進行PCR擴增。

表11  PCR擴增反應程序

溫度	時間	循環(huán)數(shù)
98 °C	1 min	1
98 °C	10 sec	參照注意事項中表2
60 °C	30 sec
72 °C	30 sec
72 °C	5 min	1
4 °C	Hold	-

3.5 擴增產(chǎn)物磁珠純化或分選 (Post Amplification Clean Up/Size Selection)

同3.3.1步驟中純化操作步驟。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)純化文庫擴增產(chǎn)物。

如需分選，操作方法同3.3.2雙輪分選步驟。

3.6 文庫質(zhì)量控制

通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質(zhì)量評價，具體請參見注意事項六。

3.7 參考實例

使用Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit for Illumina®對200 ng Human gDNA (NA12878) 樣本進行酶切建庫檢測，片段化結(jié)果見圖3，建庫結(jié)果見圖4。

圖3  OnePot Pro DNA建庫試劑盒酶切200 ng Human gDNA樣本（不同酶切時間片段化效果檢測）

 

 

圖4  使用本試劑盒進行human gDNA樣本建庫，文庫進行檢測（Input DNA為200 ng，酶切20 min，擴增5 cycles）

 

 

HB20220406