產(chǎn)品說明書
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產(chǎn)品簡介
Hieff NGS® Dual Barcode Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI®是針對MGI高通量測序平臺專門開發(fā)設(shè)計的單鏈環(huán)化試劑盒。本產(chǎn)品采用高質(zhì)量的酶和經(jīng)優(yōu)化后的Buffer組成，顯著提高反應(yīng)效率，使整個環(huán)化消化流程在30 min內(nèi)完成。本試劑盒適用于所有連接華大標準的雙標簽PCR接頭文庫擴增產(chǎn)物，除建庫試劑本身的限制外，本環(huán)化試劑盒不限MGI測序平臺。
組分信息
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組分編號 |
組分名稱 |
13340ES16 |
13340ES96 |
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13340-A |
DB Splint Oligo |
96 μL |
576 μL |
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13340-B |
Splint Buffer |
240 μL |
2×720 μL |
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13340-C |
Ligase |
80 μL |
480 μL |
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13340-D |
Digestion Buffer |
128 μL |
768 μL |
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13340-E |
Digestion Enzyme |
32 μL |
192 μL |
儲存條件
-25~-15℃保存，有效期1年。
注意事項
一、關(guān)于操作
1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。
3. 配制各步驟反應(yīng)液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。
4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。
5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。
6. 定時對各實驗區(qū)域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。
7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
二、樣本要求及處理
樣本量要求
1. 本試劑盒推薦的Input DNA量為1 pmol；若文庫產(chǎn)量不足，最低可降至0.5 pmol投入量。
2. 若有特殊的環(huán)化投入量需求，可按照需求投入，但原則上不宜超過2 pmol。
3. 不同片段大小DNA 1 pmol 分子對應(yīng)不同的質(zhì)量，可根據(jù)公式 1 計算或參考表1選擇所需的 Input DNA量：
公式 1 PCR 產(chǎn)物摩爾數(shù)與質(zhì)量間的換算
1 pmol PCR 產(chǎn)物對應(yīng)的質(zhì)量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66
表1 不同片段大小PCR產(chǎn)物1pmol對應(yīng)產(chǎn)量
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插入片段大?。?/font>bp） |
PCR產(chǎn)物主片段大小（bp） |
1 pmol對應(yīng)產(chǎn)量（ng） |
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150 |
300 |
198 |
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200 |
350 |
231 |
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250 |
400 |
264 |
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300 |
450 |
297 |
樣本混樣要求
1. Input DNA可以是單個樣本，也可以是多個帶有不同Barcodes的樣本的混合物。
2. 混合后的樣本總量推薦為1 pmol，若每個樣本所需數(shù)據(jù)量相同，則等量混合，每個樣本所需的質(zhì)量按照公式2進行計算：
公式 2 混合樣本中單個樣本所需質(zhì)量的計算
單個樣本所需的質(zhì)量(ng)=1 pmol Input DNA對應(yīng)的質(zhì)量（ng）/混合的樣本個數(shù) N
3. 單個樣本或混合后樣本用于環(huán)化時，體積應(yīng)為34 μL，若不足則用ddH2O補充至34 μL。
三、關(guān)于磁珠純化
1. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會導致純化得率下降。
2. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。
3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。
4. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應(yīng)；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥約5 min。
5. 單鏈環(huán)產(chǎn)物純化保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于-20°C可保存1個月。
四、關(guān)于文庫質(zhì)檢
1. 單鏈環(huán)產(chǎn)物純化后推薦使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 單鏈DNA熒光染料試劑對純化后產(chǎn)物進行定量。
2. 單鏈環(huán)產(chǎn)物純化后產(chǎn)量應(yīng)≥80 fmol（足夠2次上機測序）。
3. 可根據(jù)公式3計算或參考表2。
公式 3 單鏈環(huán)摩爾數(shù)與質(zhì)量間的換算
80 fmol單鏈環(huán)對應(yīng)的質(zhì)量(ng)=0.08×DNA 主片段大小(bp)×0.33
表2 不同PCR產(chǎn)物片段大小對應(yīng)80fmol單鏈環(huán)產(chǎn)量
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插入片段大?。?/font>bp） |
PCR產(chǎn)物主片段大小（bp） |
80 fmol對應(yīng)產(chǎn)量（ng） |
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150 |
300 |
7.92 |
|
200 |
350 |
9.24 |
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250 |
400 |
10.56 |
|
300 |
450 |
11.88 |
使用說明
一、自備材料
1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。
2. 文庫質(zhì)控：Cat#12645，ssDNA Assay Kit或Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit® ssDNA Assay Kit。
3. 其他材料：80%乙醇、低吸附EP管、磁力架、PCR儀等。
二、操作流程
圖1 單鏈環(huán)化文庫構(gòu)建流程
三、操作步驟
變性
- 根據(jù)文庫長度，取1 pmol 至0.2 ml PCR管中，用TE Buffer補充至34 μL。
- 將表3中試劑解凍后，顛倒混勻并置于冰上備用。
- 于冰上配制表3反應(yīng)體系。
表3 DNA變性體系
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名稱 |
體積（μL） |
|
單個或混合好的雙鏈文庫 |
34 |
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DB Splint Oligo |
6 |
|
Total |
40 |
- 混勻后，在PCR儀上進行98℃變性3 min，之后立即置于冰上，冰浴2 min 后瞬時離心。
【注】：部分PCR儀在程序結(jié)束后會迅速降溫，不及時取出會導致DNA復性，環(huán)化效率降低?？蓪⒊绦蛟O(shè)置為【98℃，hold】，在文庫放置到PCR儀上后，使用timer計時3min后將文庫立即取出置于冰上。
單鏈環(huán)化
1. 將表4中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。
2. 于冰上配制表4反應(yīng)體系。
表4 單鏈環(huán)化體系
|
名稱 |
體積（μL） |
|
上一步反應(yīng)物 |
40 |
|
Splint Buffer |
15 |
|
Ligase |
5 |
|
Total |
60 |
- 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。
4. 將PCR管置于PCR儀上，按照表5所示設(shè)置反應(yīng)程序，進行單鏈環(huán)化反應(yīng)。
表5單鏈環(huán)化反應(yīng)程序
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溫度 |
時間 |
|
熱蓋42°C |
on |
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37°C |
15 min |
|
4°C |
Hold |
酶切消化
1. 將表6中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。
2. 于冰上配制表6所示反應(yīng)體系。
表6 酶切消化體系
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名稱 |
體積（μL） |
|
上一步反應(yīng)物 |
60 |
|
Digestion buffer |
8 |
|
Digestion Enzyme |
2 |
|
Total |
70 |
3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。
4. 將PCR管置于PCR儀上，按照表7的條件進行反應(yīng)。
表7 酶切消化反應(yīng)程序
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溫度 |
時間 |
|
熱蓋42°C |
on |
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37°C |
10 min |
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4°C |
Hold |
5. 反應(yīng)結(jié)束后，瞬時離心，立即進行純化。
消化產(chǎn)物純化
該步驟使用磁珠對酶切消化的產(chǎn)物進行純化。
1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
3. 吸取120 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads至消化產(chǎn)物中，室溫孵10min。
4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約2 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。
7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂。
8. 將PCR管從磁力架中取出，加入22 μL TE Buffer，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置10 min。
9. 短暫離心，將PCR管始終置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約 2min），將上清小心移至新PCR管中。
★停止點：環(huán)化純化產(chǎn)物，可置于-20℃儲存一個月。
消化產(chǎn)物質(zhì)控
使用Qubit® ssDNA Assay Kit熒光試劑對純化產(chǎn)物進行定量，具體請參見注意事項四。
Ver.CN20250218
