產(chǎn)品簡介

Hieff NGS^® Universal Library Convert Kit可以將Illumina試劑盒構(gòu)建的雙鏈線性文庫轉(zhuǎn)化為兼容華大智造測序平臺的環(huán)狀ssDNA文庫。構(gòu)建的文庫可使用BGISEQ-500RS、 MGISEQ-200RS 和 MGISEQ-2000RS 進行測序。

組分信息

儲存條件

-25~-15℃保存，有效期1年。

注意事項

一、關于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

6. 定時對各實驗區(qū)域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。

7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

二、樣本要求及處理

2.1樣本要求

1. 樣本為線性dsDNA文庫，接頭序列符合下列之一：

單index：

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-Insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'

雙index：

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'

2. 線性dsDNA文庫插入片段范圍為 100 ~ 500 bp，同時主帶集中在±100 bp 以內(nèi)。

2.2 樣本量要求

 根據(jù)文庫總量選擇合適的線性dsDNA投入量，詳見表1：

表1  線性dsDNA總量與濃度要求

2.3 轉(zhuǎn)換PCR

不同線性 dsDNA 文庫投入量，所需 PCR 循環(huán)也不相同，詳見表2：

表2  不同線性dsDNA投入量PCR循環(huán)數(shù)推薦表

2.4 轉(zhuǎn)換文庫pooling要求

1. 不推薦在轉(zhuǎn)換PCR前對線性dsDNA進行pooling。

2. 需將接頭轉(zhuǎn)換 PCR 產(chǎn)物混合測序，則 Sample Barcode Pooling 應遵循堿基平衡的原則：最佳平衡狀態(tài) ATGC 4種堿基的占比應分別為 25% ，若不能達到 25%，則要保證每個 cycle 都存在 ATGC 四種堿基序列，并且最少的堿基不應低于 12.5%，最多的堿基不應高于 62.5%。

3. 不同片段長度的文庫不建議 pooling 環(huán)化。

4. 若樣本所需數(shù)據(jù)量相同且長度相同，則可以等量混合，每個樣本所需的質(zhì)量按照公式1進行計算：

公式1混合樣本中單個樣本所需質(zhì)量的計算

單個樣本所需的質(zhì)量 (ng)=1 pmol Input DNA 對應的質(zhì)量 (ng）/混合的樣本個數(shù) N

5. 混合后接頭轉(zhuǎn)換 PCR 產(chǎn)物總量為 1 pmol，總體積最多為 40 μL；若文庫不足則用 TE buffer補充至 40 μL。

三、關于磁珠純化（Bead-based Clean Up）

1. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致純化得率下降。

2. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

4. 產(chǎn)物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥約5 min。

5. 單鏈環(huán)產(chǎn)物純化保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于-20°C可保存1個月。

四、關于文庫質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1. 轉(zhuǎn)換文庫推薦使用 Qubit^® dsDNA HS Assay Kit 或 Quant-iT^TM PicoGreen^® dsDNA Assay Kit 等雙鏈DNA進行定量， 要求最終接頭轉(zhuǎn)換PCR產(chǎn)物的摩爾產(chǎn)量至少為1 pmol，可根據(jù)公式2計算或參考表3。

公式2 PCR 產(chǎn)物摩爾數(shù)與質(zhì)量間的換算

1 pmol PCR 產(chǎn)物對應的質(zhì)量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66

表3  不同片段大小PCR產(chǎn)物1 pmol對應產(chǎn)量

2. 單鏈環(huán)產(chǎn)物純化后推薦使用 Qubit^® ssDNA Assay Kit 單鏈 DNA 熒光染料試劑對純化后產(chǎn)物進行定量。  
3. 單鏈環(huán)狀 DNA 產(chǎn)物純化后產(chǎn)量應達到 60 fmol 以上方足夠一次上機測序的量，可根據(jù)公式3計算或參考表4 。

公式 3 單鏈環(huán)摩爾數(shù)與質(zhì)量間的換算
60 fmol 單鏈環(huán)對應的質(zhì)量 (ng)=0.06×DNA 主片段大小 (bp)×0.33

表4  不同PCR產(chǎn)物片段大小對應60 fmol單鏈環(huán)產(chǎn)量

使用說明

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. 文庫質(zhì)控：Cat#12640，dsDNA HS Assay Kit for Qubit^®或Cat#12642，1×dsDNA HS Assay kit for Qubit^®或其他等效產(chǎn)品。

3. 單鏈環(huán)質(zhì)控：Cat#12645，ssDNA Assay Kit或Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit^® ssDNA Assay Kit。

4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。

二、操作流程

圖1 通用文庫轉(zhuǎn)換流程

三、操作步驟

Part A接頭轉(zhuǎn)換PCR

1. 轉(zhuǎn)換PCR

該步驟對線性dsDNA文庫進行轉(zhuǎn)換-轉(zhuǎn)化為可以進行后續(xù)環(huán)化的線性dsDNA文庫。

1. 將表5中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。
2. 于無菌PCR管中配制表5所示反應體系。

表5  轉(zhuǎn)換PCR擴增反應體系

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設置表6所示反應程序，進行PCR擴增。

表6  PCR擴增反應程序

2、轉(zhuǎn)換PCR產(chǎn)物純化

1）準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2）渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻 

3）吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads : DNA=0.9:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，室溫孵育5 min。

4）將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5）保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6）重復步驟5，總計漂洗兩次。

7）保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8）將PCR管從磁力架中取出，進行洗脫：加入32 μL TE buffer，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。

9）將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移30 μL上清至干凈的管中。

3、轉(zhuǎn)換PCR產(chǎn)物質(zhì)檢

使用Qubit^® dsDNA HS Assay Kit等轉(zhuǎn)換PCR產(chǎn)物進行定量，具體請參見注意事項四。

Part B 轉(zhuǎn)換文庫環(huán)化

1 變性

1） 根據(jù)文庫長度，取1 pmol 至0.2 ml PCR管中，用TE Buffer補充至總體積40 μL。

2） 混勻后，在PCR儀上進行 98℃變性3 min，之后立即置于冰上，冰浴2 min后瞬時離心。

2 單鏈環(huán)化

1）將表7中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2）于冰上配制表7反應體系。

表7  單鏈環(huán)化體系

3）使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。

4.）將PCR管置于PCR儀上，按照表8所示攝制反應程序，進行單鏈環(huán)化反應。

表8  單鏈環(huán)化反應程序

3 酶切消化

1）將表9中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2）于冰上配制表9所示反應體系。