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產品簡介
UCF.ME® UltraNuclease（全能核酸酶），又稱非限制性核酸內切酶、廣譜核酸酶；是一種來源于Serratia Marcescen的非特異性核酸內切酶，可在鏈內任意核苷酸間進行切割，將核酸完全消化成2-5個堿基長度的5'-單磷酸寡核苷酸，能夠在非常廣泛的條件下(6 M Urea, 0.1 M Guanidine HCl, 0.4% Triton X-100, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF)降解各種形式的（雙鏈、單鏈、線狀、環(huán)狀、天然或變性）DNA和RNA，廣泛用于去除生物制品中的核酸。后續(xù)也可以通過相應的方法去除UCF.ME® UltraNuclease。
本試劑盒應用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測（夾心ELISA）原理檢測變性與非變性的UCF.ME® UltraNuclease全能核酸酶的殘留，用抗UCF.ME® UltraNuclease的兔多克隆抗體包被微孔板，形成固相抗體，向固相抗體酶標板(36701-A)中加入UCF.ME® UltraNuclease標準品(36701-C)和待測樣品，然后加入稀釋后的生物素標記的全能核酸酶檢測抗體(36701-B)，最后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(SA-HRP) (36701-D)，形成抗體+抗原+抗體-Biotin + SA-HRP復合物，洗板后加入TMB顯色液(36701-H)顯色。TMB在HRP酶的催化下由無色轉化成藍色并在終止液(36701-I)的作用下最終轉化成黃色。黃色的深淺與樣品中被檢測到的UCF.ME® UltraNuclease的量呈正相關。
組分信息
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組分編號 |
組分名稱 |
36701ES96 |
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36701-A |
酶標板 |
1 Plate |
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36701-B |
Detection Antibody: Biotin-conjugated Rabbit Anti-UltraNuclease Antibodies |
10 μL |
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36701-C |
Standard: UCF.ME® UltraNuclease |
1 vial (500 ng/mL) |
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36701-D |
HRP-conjugated Streptavidin |
10 μL |
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36701-E |
Dilution Buffer 1 |
45 mL |
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36701-F |
20×Wash Buffer |
50 mL |
|
36701-G |
Dilution Buffer 2 |
50 mL |
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36701-H |
TMB |
15 mL |
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36701-I |
Stop Solution |
10 mL |
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36701-J |
封板膜 |
5片 |
儲存條件
2~8℃保存*，未拆封有效期1年，拆封后有效期1個月。
*收到貨后，請檢查各組分是否齊全，并立即放入對應的保存溫度中儲存。
使用說明
- 實驗前準備
1）本試劑盒未提供，但實驗所需的實驗材料：
a. 量筒、1000 mL燒杯、不同規(guī)格的EP管
b. 無塵紙（用于洗板后拍板）
c. 無菌吸頭
d. 樣本前處理板
e. 去離子水或雙蒸餾水
2）本試劑盒未提供，但實驗所需的實驗設備和儀器：
a. 37℃恒溫箱
b. 全自動洗板機（可選）、渦旋混勻儀、離心機
c. 不同規(guī)格的精密微量移液器、多通道微量移液器
d. 計時器、4℃冰箱
e. 酶標儀（如：Molecular Devices：M和i系列）在450 nm測量吸光度(參比波長630 nm)
- 實驗方法
1）試劑、抗體準備
使用前所有試劑組分以及待測樣本需要恢復室溫。
- 1×Wash Buffer配制：
濃縮液平衡至室溫，充分溶解，不要有結晶?；靹蚝蟾鶕璧牧?，用超純水按1:20的比例，將濃縮洗液(20×)稀釋20倍，最終得到1×洗液。如：取50 mL濃縮洗液即20×Wash Buffer加入950 mL超純水中，配成1000 mL 1×洗液。若20×Wash Buffer中出現(xiàn)結晶，在50℃的水浴鍋中溫浴，直至結晶完全消失。
- Detection Antibody配制：
使用前10000 rpm離心20 sec，然后用Dilution Buffer 2將檢測抗體以1:2500稀釋至工作濃度使用。
- Streptavidin-HRP配制：
使用前10000 rpm離心20 sec，然后用Dilution Buffer 2以1:5000稀釋至工作濃度使用。
2）標準品溶液制備
提前準備8個無菌的1.5 mL離心管，按照標準品濃度依次進行標記。移取994 μL Dilution Buffer 1至標記為3 ng/mL的離心管中，其余各管移取500 μL。根據標準品儲存液濃度計算3 ng/mL標準品應移取的儲液體積，加至標記為3 ng/mL的離心管中混勻。再取500 μL至下一個標記濃度的離心管中，混勻，進行一系列2倍梯度稀釋標品。
起始最高濃度標記3 ng/mL，最低濃度為0.047 ng/mL，可按照下面的配制方法來進行。每次試驗均需制備相應的標準曲線，不同試劑盒以及不同時間的標準曲線不能混用。樣本測試時，每個孔所需標品量為100 μL，注意配制體積要高于所需體積，避免體積使用量不足。
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圖1 UCF.ME® UltraNuclease標準品制備流程圖
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管號 |
Dilution Buffer 1體積(μL) |
加入的標準品和體積(μL) |
標準品終濃度(ng/mL) |
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A |
994 |
6 (500 ng/mL) |
3 |
|
B |
500 |
500 A |
1.5 |
|
C |
500 |
500 B |
0.75 |
|
D |
500 |
500 C |
0.375 |
|
E |
500 |
500 D |
0.188 |
|
F |
500 |
500 E |
0.094 |
|
G |
500 |
500 F |
0.047 |
|
H |
300 |
0 |
0=Blank |
表1 UCF.ME® UltraNuclease標準品體系配制（酶標儀檢測0.047~3 ng/mL）
3）待測樣本制備
將樣本按照一定的稀釋倍數(shù)進行稀釋。樣本具體的稀釋倍數(shù)，需要通過樣本加標，評估加標回收率和稀釋線性后，確定合適的稀釋倍數(shù)。
4）實驗步驟
使用前所有試劑組分以及待測樣本需要恢復室溫。強烈建議所有的標準品和待檢樣本進行雙復孔測定。
- 試劑準備：提前準備好各種待測試劑、稀釋好的標準品和待測樣本。
- 酶標板條確定：計算待測樣本和標準品所需酶標板條，將酶標條從鋁箔袋取出，剩余的酶標條放回鋁箔袋中并封好袋口，低溫保存。
- 清洗酶標板：用1×Wash Buffer（300 μL/孔）洗板三次，拍干酶標板。洗板對實驗結果有重要影響，確保最后一次拍板沒有洗液殘留。
- 孵育樣本：加入標準品和待測樣本，100 μL/孔，確保15 min內完成點樣，37℃孵育1 h。
- 清洗酶標板：棄去孔中液體，加入1×Wash Buffer（300 μL/孔）洗板五次，拍干酶標板。
- Detection Antibody即Biotin-conjugated Antibodies孵育：將預先配制至工作濃度的檢測抗體加入酶標板，100 μL/孔，37℃孵育1 h。
- 清洗酶標板：棄去孔中液體，加入1×Wash Buffer（300 μL/孔）洗板五次，拍干酶標板。
- HRP-conjugated Streptavidin孵育：將預先配制至工作濃度的偶聯(lián)HRP的鏈霉親和素加入酶標板，100 μL/孔，37℃孵育40 min。
- 清洗酶標板：棄去孔中液體，加入1×Wash Buffer（300 μL/孔）洗板五次，拍干酶標板。
- 顯色：使用前10 min將底物液恢復至室溫，將底物液TMB加入酶標板中，100 μL/孔，37℃避光孵育15 min。
- 終止：加入50 μL/孔終止液至酶標板中，輕輕震動酶標板至顯色均勻。
- 讀值：20 min內讀取450 nm/630 nm波長處的吸光度值。450 nm作為檢測波長，630 nm作為參比波長。
5）結果分析
a. 如果待測樣本OD值超出標準曲線最高點OD值，需將樣本進行稀釋后重新測定。
b. 曲線制定：以標準品濃度為橫坐標，校準后的標準品吸光度值（OD 450 nm-630 nm）為縱坐標繪制標準曲線。多種繪圖和統(tǒng)計學軟件可以用于輔助繪制標準曲線并進行未知樣本濃度的計算。四參數(shù)擬合法往往曲線擬合效果較好，其它方法如線性，雙對數(shù)法也可能獲得較好擬合結果，需要根據具體實驗數(shù)據進行分析。最終依據標準曲線和樣本的稀釋倍數(shù)計算樣本中宿主蛋白濃度。
c. 典型的參考標準曲線如下（以下標準曲線圖僅供參考，應以同次實驗標準品所繪標準曲線計算樣本含量）：
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標曲（ng/mL） |
OD |
平均OD |
校準值 |
|
|
3.000 |
2.205 |
2.189 |
2.197 |
2.198 |
|
1.500 |
1.520 |
1.543 |
1.532 |
1.528 |
|
0.750 |
0.974 |
0.962 |
0.968 |
0.971 |
|
0.375 |
0.579 |
0.588 |
0.584 |
0.587 |
|
0.188 |
0.353 |
0.351 |
0.352 |
0.353 |
|
0.094 |
0.228 |
0.221 |
0.225 |
0.221 |
|
0.047 |
0.154 |
0.155 |
0.155 |
0.150 |
|
0.000 |
0.070 |
0.067 |
0.069 |
0.074 |
圖2：UCF.ME® UltraNuclease標準曲線圖 表2 UCF.ME® UltraNuclease標準曲線數(shù)據
6）實驗流程圖
圖3：實驗步驟流程簡圖
產品性能
本試劑盒性能經過充分評估，標曲范圍為0.047~3 ng/mL，板內精密度CV<10%和板間精密度CV<15%，準確度滿足75%~125%范圍，檢測限為0.0235 ng/mL（即23.5 pg/mL）。
注意事項
1）使用本試劑盒前請仔細閱讀本說明書；
2）請在有效期內使用該產品，禁止不同批次的相關試劑進行混用；
3）所有試劑在使用之前，均需要恢復至室溫；
4）本產品僅能夠應用于檢測說明書中標注的靶點抗原與樣本。其它應用需經使用者設計驗證后，根據結果評估使用的可靠性與準確性；
5）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作；
6）本產品僅用作科研用途。
Ver.CN20240618
