產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
Hieff NGS® One-Step rRNA Removal Kit (Human，1-100 ng)利用靶向技術(shù)在cDNA合成過程中高特異性地抑制人總RNA中的核糖體RNA的逆轉(zhuǎn)錄，而不影響信使RNA (mRNA)、非編碼RNA以及環(huán)狀RNA等非靶RNA的cDNA合成，從而在一鏈cDNA合成過程中高特異性去除核糖體RNA。這種靶向去除技術(shù)相較于傳統(tǒng)的RNase H消化法具有耗時(shí)短 (3 min)、操作簡單（一步操作）和非靶RNA保留完整等優(yōu)點(diǎn)，極大簡化了操作流程和提高了建庫效率，可以與市面上各類一鏈cDNA合成試劑配套。該試劑盒對于完整和部分降解的總RNA（如FFPE RNA）均具有良好的rRNA去除效果。經(jīng)rRNA去除所獲得的cDNA樣本可用于高通量測序分析mRNA和非編碼RNA，可顯著提高測序結(jié)果中有效數(shù)據(jù)比例，也可用于其它c(diǎn)DNA下游應(yīng)用。提供的試劑已經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制和功能驗(yàn)證，最大程度上保證了rRNA去除的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
適用范圍
適用于人來源的1-100 ng 總RNA樣品；適用于完整或部分降解RNA（如FFPE RNA）樣品。
產(chǎn)品組分
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產(chǎn)品組份 |
12259ES08 |
12259ES24 |
12259ES96 |
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One-Step rRNA Removal Mix |
8 μL |
24 μL |
96 μL |
運(yùn)輸與保存方法
干冰運(yùn)輸，-20°C存放。效期兩年。
注意事項(xiàng)
一、 關(guān)于操作
1. 請使用無RNase污染的耗材，并對實(shí)驗(yàn)區(qū)域定期進(jìn)行清理，推薦使用Thermo Fisher公司的RNAZap™ 高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。
2. RNA樣品應(yīng)不含基因組DNA污染，若樣品中有g(shù)DNA殘留，應(yīng)先進(jìn)行DNase I消化并純化后再用于本試劑盒。
3.若樣品體積較大，可先進(jìn)行濃縮。
4. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
5. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
二、自備材料
1. qRT-PCR質(zhì)檢rRNA去除效率：Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox) (Cat#11201)或其他等效產(chǎn)品；
2. 其他材料：無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、PCR儀等。
使用方法
一、操作流程
圖1. 使用快速去除核糖體RNA試劑盒+RNA建庫試劑盒進(jìn)行RNA建庫流程
二、操作步驟
方案1：在逆轉(zhuǎn)錄體系中去除rRNA。
1. 使用翌圣生物的Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat#11119)進(jìn)行本試劑盒rRNA去除效率測試，其他逆轉(zhuǎn)錄試劑盒也可以用于本測試。
2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制（20 μL體系）
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RNA不片段化體系 |
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RNA片段化體系 |
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Total RNA |
1-100 ng |
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Total RNA |
1-100 ng |
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Random Primers N6 (50 μM) |
1 μL |
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Random Primers N6 (50 μM) |
1 μL |
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One-Step rRNA Removal Mix |
1 μL |
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One-Step rRNA Removal Mix |
1 μL |
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5×Hifair® Ⅱ Buffer |
4 μL |
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RNase free ddH2O |
To 14 μL |
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RNase free ddH2O |
To 18 μL |
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混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：
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混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)： |
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94℃（片段化溫度和時(shí)間可根據(jù)需求自行調(diào)整） |
5 min |
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75℃ |
1 min |
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75℃ |
1 min |
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50℃ |
2 min |
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50℃ |
2 min |
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4℃ |
Hold |
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4℃ |
Hold |
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上述反應(yīng)體系 |
14 μL |
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上述反應(yīng)體系 |
18 μL |
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5×Hifair® Ⅱ Buffer |
4 μL |
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Hifair® Ⅱ Enzyme Mix |
2 μL |
|
Hifair® Ⅱ Enzyme Mix |
2 μL |
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Total |
20 μL |
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Total |
20 μL |
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混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：
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混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)： |
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25℃ |
5 min |
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25℃ |
5 min |
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42℃ |
30 min |
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42℃ |
15 min |
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85℃ |
5 min |
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85℃ |
15 min |
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圖2.qPCR驗(yàn)證一步rRNA快速去除試劑盒的去除效果
方案2：在RNA NGS文庫構(gòu)建中去除rRNA。
1. 使用翌圣生物的Hieff NGS® Dual-mode RNA Library Prep Kit (Cat#12252 for Illumina, 13333 for MGI)進(jìn)行本試劑盒rRNA去除效率測試。
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RNA片段化 |
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組份 |
體積 |
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Total RNA |
1-100 ng |
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2×Frag/Prime Buffer |
8.5 μL |
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One-Step rRNA Removal Mix |
1 μL |
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DEPC H2O |
to 17 μL |
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混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)： |
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溫度 |
時(shí)間 |
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94℃（片段化溫度和時(shí)間可根據(jù)需求自行調(diào)整） |
5 min |
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75℃ |
1 min |
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50℃ |
2 min |
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4℃ |
Hold |
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組份 |
體積 |
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上述反應(yīng)體系 |
17 μL |
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Strand Specificity Reagent |
6 μL |
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1st Strand Enzyme Mix |
2 μL |
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Total |
25 μL |
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混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)： |
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溫度 |
時(shí)間 |
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25℃ |
10 min |
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42℃ |
15 min |
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70℃ |
15 min |
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接Step 2第二鏈cDNA的合成/末端修復(fù)/加A |
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圖3. 二代測序驗(yàn)證一步rRNA快速去除試劑盒的去除效果
2. 使用New England Biolabs的NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (Cat#E7760)聯(lián)合本試劑盒進(jìn)行rRNA去除方案。
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RNA片段化 |
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組份 |
體積 |
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Total RNA |
1-100 ng |
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First Strand Synthesis Reaction Buffer (5×) |
4 μL |
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Random Primers |
1 μL |
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One-Step rRNA Removal Mix |
1 μL |
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DEPC H2O |
to 10 μL |
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混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)： |
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溫度 |
時(shí)間 |
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94℃（片段化溫度和時(shí)間可根據(jù)需求自行調(diào)整） |
5 min |
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75℃ |
1 min |
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50℃ |
2 min |
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4℃ |
Hold |
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接下游一鏈合成體系 |
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