產(chǎn)品簡介

 

GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF是一種GST標(biāo)簽蛋白純化樹脂，結(jié)構(gòu)上是以高度交聯(lián)的4%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過12個原子的間隔臂，用化學(xué)方法共價結(jié)合還原型谷胱甘肽制作而成，具有更高的物理化學(xué)特性，可以耐受更高的壓力，在相對較高的流速下，實(shí)現(xiàn)對目的蛋白的純化，更適于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化。

此外，本品特異性好，性價比高，可以一步純化各種表達(dá)系統(tǒng)中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽依賴性蛋白和谷胱甘肽重組衍生物。

 

產(chǎn)品信息

 

貨號	20508ES10/20508ES50/20508ES60/20508ES80
規(guī)格	10 mL /50 mL /100 mL/1000 mL

 

產(chǎn)品性質(zhì)

 

基質(zhì)（Matrix）	高度交聯(lián)的4%瓊脂糖微球
配體（Ligand）	通過12原子間隔臂偶聯(lián)的谷胱甘肽
粒徑（Bead size）	45-165 µm
載量（Capacity）	>10 mg GST蛋白（40 kDa）/mL基質(zhì)
最大壓力（PressureMax）	0.3 MPa，3 bar
pH穩(wěn)定范圍（pH range）	3-12
儲存緩沖液（Buffer）	含20%乙醇的1×PBS

 

儲存條件

 

2~8℃保存，有效期2年。

 

需準(zhǔn)備試劑

 

所用水和Buffer在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾除菌。

平衡/洗雜緩沖液：140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.4

洗脫緩沖液：用平衡液配制10 mM 還原型谷胱甘肽（現(xiàn)配現(xiàn)用）

【注】平衡/洗雜緩沖液或洗脫緩沖液中可加入1-10 mM DTT。

 

使用說明

 

【注】樣品在上樣前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾，減少雜質(zhì)以防阻塞柱子。

1.   GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF的裝填（適用于各種中壓色譜層析柱的填裝）

1）用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭，確保柱底篩板上無氣泡，關(guān)閉柱底出口，并在柱底部留出1-2 cm的去離子水。

2）將樹脂懸浮起來，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生。

3）如果使用儲液器，應(yīng)立即在層析柱和儲液器中加滿水，將進(jìn)樣分配器放置于漿液表面，連接至泵上，避免在分配器或進(jìn)樣管中產(chǎn)生氣泡。

4）打開層析柱底部出口，開起泵，使其在設(shè)定的流速下進(jìn)行。最初應(yīng)讓緩沖液緩慢流過層析柱，然后緩慢增加至最終流速， 這樣可避免液壓對所形成柱床的沖擊，避免柱床形成的不均勻。如果達(dá)不到推薦的壓力或流速，可以用所使用泵的最大流速，這樣也可以得到一個很好的裝填效果。

【注】：在隨后的色譜程序中，不要超過最大裝柱流速的75%，當(dāng)柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上3倍柱床體積的去離子水。標(biāo)上柱床高度。

5）關(guān)閉泵，關(guān)閉層析柱出口。

6）如果使用儲液器，去除儲液器，將分配器至于層析柱中。

7）將分配器推向柱子至標(biāo)記的柱床高度處。允許裝柱液進(jìn)入分配器，鎖緊分配器接頭。

8）將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中，開始平衡。如果需要可以重新調(diào)整分配器。

2. 樣品純化

1）平衡：用5倍柱體積的平衡Buffer平衡柱子，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護(hù)蛋白的作用。

2）上樣：Resin平衡后，加入蛋白樣品，使其與Resin充分接觸，提高目的蛋白回收率，收集流出液。

3）洗雜：用10-15倍柱體積的洗雜緩沖液進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

4）洗脫：使用5-10倍柱體積的洗脫緩沖液，收集洗脫液，即目的蛋白溶液。

5）清洗與保存：依次使用3倍柱體積的平衡Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料，最后用5倍柱體積的20%的乙醇平衡，然后保存在等體積的20%乙醇中，置于4℃保存，防止填料被細(xì)菌污染。

3. SDS-PAGE檢測

將純化過程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測，判定其純化效果。

4.   填料清洗

GST標(biāo)簽蛋白純化產(chǎn)品可以重復(fù)使用而無需再生，但隨著非特異結(jié)合蛋白的增多和蛋白的聚集，會造成流速和結(jié)合載量性能下降，此時需對填料進(jìn)行清洗。

1）去除一些沉淀或變形物質(zhì)

用2倍柱體積的6 M鹽酸胍溶液進(jìn)行清洗，然后立即用5倍柱體積的PBS，pH 7.4清洗。

2）去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質(zhì)

用3-4倍柱體積的70%乙醇或2倍柱體積1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱體積的PBS，pH 7.4清洗。

 

注意事項(xiàng)

 

1.請勿冷凍保存本產(chǎn)品。

2.GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF使用前一定要充分顛倒若干次，使瓊脂糖珠混合均勻。

3.所有操作過程中，樣本需要在4℃或冰上操作。

4.本產(chǎn)品僅作科研用途。

5. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

 

附表 問題及解決方案

 

問題	可能原因	推薦解決方案
柱子反壓過高	填料被堵塞	清洗樹脂
		裂解液中含有微小的固體顆粒，建議上樣前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾，或離心去除
	樣品太黏稠	樣品中含高濃度的核酸，延長破碎時間直至粘度降低，或添加DNaseI （終濃度為5 µg/mL），Mg2+（終濃度1 mM），冰上孵育10-15 min
	緩沖液太黏稠	有機(jī)試劑或蛋白穩(wěn)定試劑（如甘油等）可能會引起反壓增高，降低操作流速
洗脫組分中無目的蛋白	GST標(biāo)簽蛋白變性了	使用溫和的裂解條件，實(shí)驗(yàn)條件以經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)
	過度的裂解使目的蛋白變性
	目的蛋白聚集產(chǎn)生沉淀	在細(xì)胞裂解前溶液中加入DTT，終濃度為1-10 mM
	融合蛋白改變了GST的構(gòu)象，影響了目的蛋白的結(jié)合力	測定pGEX中GST的結(jié)合力，對載體進(jìn)行超聲處理，檢測其結(jié)合力。如果載體中GST有很高的親和力，有可能是改變?nèi)诤系鞍椎臉?gòu)象從而降低了GST標(biāo)簽蛋白的親和力
		降低結(jié)合溫度至4℃，充分清洗
	柱子平衡時間太短，目的蛋白不是在pH 6.5-pH 8.0范圍內(nèi)結(jié)合	用pH 6.5-pH 8.0的buffer進(jìn)行充分的平衡，如PBS
目的蛋白沒有完全洗脫下來	洗脫體積太少	增加洗脫液體積，減小洗脫流速。
	洗脫液中谷胱甘肽濃度太低	增加洗脫液中還原型谷胱甘肽濃度，可嘗試用20-40 mM還原型谷胱甘肽洗脫
	低pH影響洗脫	在不增加洗脫液中谷胱甘肽量時，提高洗脫液中pH至pH 8-9會有改善
		增加洗脫液中離子強(qiáng)度，如0.1-0.2 M NaCl
	洗脫液中谷胱甘肽被氧化	使用新鮮配制的洗脫液
		加入DTT
	非特異性疏水作用影響目的蛋白的溶解和洗脫	洗脫液中加入非離子型洗滌劑，如0.1%的Triton X-100或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20
電泳或Western Blot檢測中發(fā)現(xiàn)多條帶	Mr 70000蛋白與目的蛋白一起純化下來	Mr 70000蛋白可能是大腸桿菌基因DnaK的產(chǎn)物，可以在目的蛋白中加入50 mM Tris-HCl，2 mM ATP，10 mM MgSO4，pH 7.4在37℃加熱10min去除
		可通過ATP-瓊脂糖膠或離子交換來去除目的蛋白溶液中的dnaK蛋白
	GST融合蛋白已經(jīng)發(fā)生降解	在裂解液中加入蛋白酶抑制劑，如加入1 mM PMSF
		可能是蛋白酶對目的蛋白部分降解造成的，可使用蛋白酶缺陷型宿主菌（如lon-或ompT）
	細(xì)胞破碎過度	減少細(xì)胞破碎時間，超聲前加入溶菌酶（菌液體積的0.1倍10 mg/mL溶菌酶，25 mM Tris-HCl，pH 8.0），避免發(fā)泡導(dǎo)致蛋白酶變性，過度超聲破碎增加宿主內(nèi)源蛋白與GST融合目的蛋白的共純化。
	共價共純化	包括促進(jìn)蛋白正確折疊的分子伴侶的共純化，如：DnaK（Mr～70000），DnaJ（Mr～37000），GrpE（Mr～40000），GroEL（Mr～57000），GroES（Mr～10000）
	抗體與E. coli的各種蛋 白反應(yīng)	抗體吸附E. coli蛋白：GST-抗體；超聲處理去除GST抗體，可以用Western Blot檢測

Ver.CN20230921