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      FITC Phalloidin FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽
       
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      產(chǎn)品說明書
                  
      FAQ
                  
      COA
                  
      已發(fā)表文獻(xiàn)
                  
       
      背景描述
      


      鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環(huán)狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM）選擇性結(jié)合于絲狀肌動蛋白F-actin，而不會與單體肌動蛋白G-actin結(jié)合，通常用來標(biāo)記組織切片，細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞體系中的F-actin，從而對F-actin進(jìn)行定性和定量分析。另外，鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維，無論是動植物來源的肌肉細(xì)胞或非肌肉細(xì)胞，按照每一個肌動蛋白亞基約與一個鬼筆環(huán)肽分子的計量比結(jié)合。非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識度非常明顯。因此，鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動蛋白（Actin）抗體進(jìn)行相關(guān)研究。另外鬼筆環(huán)肽衍生物很小，直徑約12-15Å，分子量＜2000 Daltons，未標(biāo)記肌動蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持，比如，同肌動蛋白結(jié)合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能發(fā)生反應(yīng)；鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質(zhì)；以及甘油抽提的肌纖維標(biāo)記后仍可收縮等。
      


      鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態(tài)平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1 µg/mL，因此，可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。
      


      本品為FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，染色反應(yīng)特異性強，對比性高，具有比Actin抗體更好的染色效果，適合用作F-actin的定性和定量檢測。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學(xué)特性。且本品的結(jié)合沒有物種差異性，適用性廣泛。
      


      我司提供儲存液形式（濃度為20 µM）的FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽，用戶根據(jù)自身需求選擇，建議使用濃度為80~200 nM。
      


       
      


      產(chǎn)品性質(zhì)
      


      
	
		
      
			
			
      分子式（Molecular Formula）
      
			      		
			
			
      C56H60N10O15S2
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      分子量（Molecular Weight）
      
			      		
			
			
      1177.3 
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      最大激發(fā)/發(fā)射波長（Ex/Em）
      
			      		
			
			
      495~496/513~516 nm
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      多肽序列（Sequence）
      
			      		
			
			
      FITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-Trp-4-hydroxy-5-amino-Leu)(S-3 to 6)
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      外觀（Appearance）
      
			      		
			
			
      淡黃色至黃色溶液
      
			      		
		
      
	      

      


       
      


      運輸與保存方法
      


      冰袋運輸。-20 ℃避光干燥保存，1年有效。
      


       
      


      注意事項
      


      1）鬼筆環(huán)肽具有毒性，需小心操作（對人的半數(shù)致死劑量LD50約2 mg/kg）。
      


      2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
      


      3）本產(chǎn)品僅作科研用途！
      


       
      


      需要自備材料
      


      1）（可選）甲醇
      


      2）1×PBS緩沖液，pH 7.4，細(xì)胞培養(yǎng)級別
      


      3）固定液4%多聚甲醛（溶于PBS緩沖液）
      


      4）丙酮或透化液0.5% Triton X-100（溶于PBS緩沖液）
      


      5）Fluoromount-GTM 水溶性封片劑（不含DAPI）（貨號：36307ES08），DAPI（貨號：40727ES10）
      


      6）（可選）DAPI Fluoromount-GTM 水溶性封片劑（含DAPI）（貨號：36308ES11）
      


      7）（可選）BSA，標(biāo)準(zhǔn)級別（貨號：36101ES25）
      


      8）載玻片和蓋玻片
      


      9）蓋玻片周圍密封液（如透明指甲油）
      


      10）組裝有FITC激發(fā)/發(fā)射濾片，以及DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片的熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡
      


      操作步驟
      


      1. 工作液準(zhǔn)備
      


      本品以溶于甲醇的20 µM儲存液形式提供，總量為300 µL。按照100 nM的工作液濃度來換算，可制備總量為60 mL的工作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對母液進(jìn)行小量分裝，-20 ℃避光凍存，一年穩(wěn)定。
      


      開始實驗前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200 nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。
      


      2. 染色步驟
      


      1）細(xì)胞爬片生長24 h，使其密度達(dá)到50%匯合度。
      


      2）吸掉培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞2次。
      


      3）使用溶于PBS的4%甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定10 min。
      


      注意：避免固定劑中含有甲醇成分，因為甲醇在固定過程中可能破壞肌動蛋白。
      


      4）室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10 min。
      


      5）室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用0.5% Triton X-100溶液透化處理5 min。
      


      6）室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10 min。
      


      7）取200 µL配制好的 FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育30 min（通常情況下，4 ℃~37 ℃孵育皆可）。
      


      注意：為了降低背景，可于FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入1% BSA；另外，孵育過程中為了避免溶液揮發(fā)，可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個密封的容器內(nèi)。
      


      8）用PBS清洗蓋玻片3次，每次5 min。
      


      9）使用200 µL DAPI溶液（濃度：100 nM）對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，約30 s。
      


      10）用PBS清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑，然后用指甲油永久封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于4 ℃避光保存，通常6個月內(nèi)可繼續(xù)做F-actin染色分析。
      


      注意：也可以直接使用含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑（貨號：36308ES11）合并步驟9）10），簡化步驟。
      


        
	
      1. 熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察，選擇FITC激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=496/516 nm）和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454 nm）。
        2. 

      


       
      


      HB240410
      


       
      

         
       
       
       
       
       
       
       
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