5×Hifair^® Ⅲ Buffer 可與Hifair^® Ⅲ Reverse Transcriptase (Cat#14601)配套使用，為逆轉(zhuǎn)錄創(chuàng)造最佳條件。

 

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)	組分名稱	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
		15662ES03	15662ES08	15662ES50
15662-A	5×Hifair® Ⅲ Buffer	1 mL	5 mL	50 mL

 

產(chǎn)品應(yīng)用

全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建；終點(diǎn)法PCR；實(shí)時(shí)定量PCR等。

 

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，有效期1年。

 

注意事項(xiàng)

1）請(qǐng)保持實(shí)驗(yàn)區(qū)域潔凈；操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩；實(shí)驗(yàn)所用耗材均需保證RNase free，以防止RNase污染。

2）所有操作均應(yīng)在冰上進(jìn)行，防止RNA降解。

3）為保證高效率逆轉(zhuǎn)錄，建議使用高質(zhì)量的RNA樣本。

4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

5）本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

第一鏈cDNA合成操作步驟

1. RNA變性（此步為可選步驟，RNA變性有助于打開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)，可在很大程度上提高第一鏈cDNA的產(chǎn)量。）

組分	使用量
RNase-free H2O	to 13 μL
Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers (50 μM)   or Gene Specific Primers (2 μM)	1 μL
	or 1 μL
	or 1 μL
模板RNA	Total RNA: 10 pg -5 μg或mRNA:10 pg-500 ng

65℃加熱5 min，迅速置于冰上冷卻2 min。簡(jiǎn)短離心收集反應(yīng)液后加入下表中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，并用移液器輕輕吹打混勻。

2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制（20 μL體系）

組分	使用量
上一步的反應(yīng)液	13 μL
5×Hifair® Ⅲ Buffer	4 μL
dNTP Mix (10 mM)	1 μL
Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase (800 U/μL) (Cat#14601)	200 U
RNase inhibitor (40 U/µL)	1 μL

3. 逆轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置

溫度	時(shí)間
25℃	5 min
55℃	15-30 min
85℃	5 min

【注】：1）當(dāng)使用Random Primers時(shí)，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers，此步可省略；

2）逆轉(zhuǎn)錄溫度：推薦使用55℃；對(duì)于高GC含量模板或者復(fù)雜模板，可將逆轉(zhuǎn)錄溫度提高到60℃；

3) 可將逆轉(zhuǎn)錄時(shí)間延長(zhǎng)到45-60min，有助于提高產(chǎn)量；

4）85℃加熱5 min，目的是使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。

※ 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于后續(xù)PCR或qPCR反應(yīng)，也可-20℃短期保存，若需長(zhǎng)期保存，建議分裝后，于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

HB220615