產(chǎn)品簡介

 

SulfoLink Coupling Agarose Resin是一類預(yù)活化的瓊脂糖樹脂，其純化原理在于可以通過與巰基的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)抗原的固定化，進(jìn)而利用抗原抗體的特異性反應(yīng)對免疫血清中的抗體進(jìn)行高效純化，是多克隆抗體生產(chǎn)中不可缺少的純化介質(zhì)。

 

產(chǎn)品性質(zhì)

 

基質(zhì)（Matrix）	4%瓊脂糖微球
配體（Ligand）	碘乙酸衍生物
粒徑（Bead size）	45-165 µm
載量（Capacity）	4.0-6.0 mg HC-7多肽/mL基質(zhì)
最大壓力（PressureMax）	0.1 MPa, 1 bar
pH穩(wěn)定范圍（pH range）	5-10
儲存緩沖液（Buffer）	1 M NaCl溶液

 

儲存條件

 

2~8℃保存，有效期2年。

 

使用說明

 

1. 緩沖液準(zhǔn)備

所用水和Buffer在使用之前建議用0.22 μm或0.45 μm濾膜過濾。

偶聯(lián)液：50 mM Tris，5 mM EDTA-Na，pH 8.5

封閉液：50 mM Tris，5 mM EDTA-Na，50 mM L-半胱氨酸，pH 8.5

保護(hù)液：含20%乙醇的1×PBS

平衡/洗雜液：150 mM NaCl，20 mM Na₂HPO₄，pH 7.0

洗脫液：0.1 M 甘氨酸，pH 3.0

中和液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

2. 抗原準(zhǔn)備

純化樣品在上樣前建議用0.22 μm或0.45 μm濾膜過濾，減少雜質(zhì)，提高蛋白純化效率和防止堵塞柱子。

使用偶聯(lián)液溶解抗原，制備成終濃度為 1-3 mg/mL的抗原溶液。建議該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，儲存時間過長會影響偶聯(lián)效果。

注：① 抗原樣品使用前務(wù)必確保其巰基處于還原狀態(tài)（可以使用 DTNB(Ellman's Reagent)（Cat#60306ES）檢測自由巰基的含量）。如果巰基已經(jīng)氧化，必須對抗原樣品進(jìn)行還原，一般推薦使用還原劑 TCEP hydrochloride（Cat#20330ES），TCEP 溶液很穩(wěn)定，可以選擇性的、高效的打開抗原中的二硫鍵，并且不影響抗原與樹脂的偶聯(lián)反應(yīng)，每毫克抗原中 TCEP 的添加量不超過12 mg，具體使用量需要自行優(yōu)化。

② 如果使用 DTT 等含有巰基的還原劑，處理完樣品必須要將還原劑去除，否則會影響抗原與樹脂的偶聯(lián)效率。

3. 抗原偶聯(lián)

1）取適量SulfoLink Coupling Agarose Resin，加入到合適的重力柱中，靠重力流干保護(hù)液，用3倍柱體積的偶聯(lián)液平衡樹脂，待偶聯(lián)液流干，再加入3倍柱體積的偶聯(lián)液，重復(fù)操作 2遍。共使用9倍柱體積的偶聯(lián)液。

2）關(guān)閉柱子的下端出口，加入等體積的含巰基的抗原，混勻，取出至合適的離心管中，置于28℃震蕩孵育30 min。

注：確保樹脂充分懸浮起來，否則將大大影響偶聯(lián)效率。

3）將上述反應(yīng)體系取出，轉(zhuǎn)移至重力柱中，流干其中溶液，并收集流出液，再用3倍柱體積的偶聯(lián)液清洗樹脂，合并兩次流出液。

注：如有需要，可以使用Ellman's Reagent檢測其中巰基含量，得出抗原殘留量，從而計算偶聯(lián)效率。

4）關(guān)閉柱子的下端出口，加入等體積的封閉液，混勻，轉(zhuǎn)移至合適的離心管中，于28℃震蕩孵育30 min。

5）將上述反應(yīng)體系取出，轉(zhuǎn)移至重力柱中，流干其中的封閉液。

注：如果立即使用，可以參考【抗體純化】操作。如果以后使用，可以用3倍柱體積的結(jié)合液清洗樹脂，然后保存在等體積的保護(hù)液中，于 4℃冰箱保存。

4. 抗體純化

1）將偶聯(lián)了抗原的樹脂裝入合適的層析柱，用5倍柱體積的結(jié)合液進(jìn)行平衡，使樹脂處于與抗體更易結(jié)合環(huán)境中，一方面保護(hù)目標(biāo)抗體，另一方面提高抗體結(jié)合效率。

2）將含有抗體的樣品加到平衡好樹脂中，為了保證抗體與樹脂充分接觸，提高目標(biāo)抗體的回收率，可以控制上樣流速在0.5-1 mL/min，并收集流出液。

3）用10-15倍柱體積的洗雜液進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，提高目的抗體的純度，收集洗雜液。

4）使用5-10倍柱體積的洗脫液，收集洗脫組分，即目的抗體。

注：為了保持抗體活性，需要立即將洗脫組分透析至pH 7.0-8.0的緩沖液中，或者先加入1/10倍洗脫組分體積的中和液，將洗脫組分進(jìn)行中和，再透析。

5）依次使用3倍柱體積的結(jié)合液和5倍柱體積的去離子水平衡樹脂，最后再用5倍柱體積的保護(hù)液平衡，然后保存在等體積的保護(hù)液中，置于4℃保存，防止填料被細(xì)菌污染。

5. SDS-PAGE 檢測

將純化抗體樣品得到的流出組分、洗雜組分和洗脫組分以及原始含抗體樣品使用SDS-PAGE檢測純化效果。

 

注意事項

 

1.SulfoLink Coupling Agarose Resin使用前一定要充分顛倒若干次，使瓊脂糖珠混合均勻。

2所有操作過程中，樣本需要在4℃或冰上操作。

3.本產(chǎn)品僅作科研用途。

4. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

 

附表 問題及解決方案

問題	原因分析	推薦解決方案
柱子流速低	篩板被堵塞	清洗或更換篩板
	樣品或樹脂中有氣泡	輕輕攪拌樹脂或敲擊層析柱去除氣泡
偶聯(lián)液中蛋白或多肽沉淀	蛋白或多肽不溶	偶聯(lián)液中加入＜30%的DMSO或DMF或6 M鹽酸胍促進(jìn)樣品溶解
偶聯(lián)效率低	樣品無巰基，被氧化	加入DTT或TECP后立即交聯(lián)
洗脫組分純度低	樹脂沒有徹底清洗	增加結(jié)合/洗雜液體積

 

 

Ver.CN20241031