Hieff NGS® MagSP rRNA Removal Kit (Zebra fish) with purification beads是利用鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠去除斑馬魚來源總RNA中的核糖體RNA以保留信使RNA（mRNA）和其他非編碼RNA。該試劑盒對于完整和部分降解的總RNA均具有良好的rRNA去除效果。經(jīng)rRNA去除所獲得的RNA樣本可用于高通量測序分析的mRNA和非編碼RNA，可顯著提高測序結(jié)果中有效數(shù)據(jù)比例，也可用于cDNA合成及其它下游應(yīng)用。

 

適用范圍

適用于斑馬魚來源的10 ng~1 μg 總RNA樣品。

 

產(chǎn)品組分

組分編號和名稱			12269ES04	12269ES24	12269ES96
BOX I	12269-A	PM, Probe Mix	13.5 μL	80 μL	317 μL
BOX II	12269-B	HB, Hybridization buffer	25 μL	150 μL	600 μL
	12269-C	DB, Depletion buffer	800 μL	4.6 mL	18.5 mL
	12269-D	SMB, Streptavidin-coated magnetic beads	176 μL	1056 μL	4.23 mL
	12269-E	PB, Purification beads	795 μL	4.75 mL	19 mL

 

儲存條件

試劑盒BOXI（Probe Mix）-25~-15℃保存，BOXII2~8℃保存，有效期1年。

 

注意事項

1. 請使用無RNase污染的耗材，并對實驗區(qū)域定期進(jìn)行清理，推薦使用Thermo Fisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

2. RNA樣品應(yīng)不含基因組DNA污染，若樣品中有g(shù)DNA殘留，應(yīng)先進(jìn)行DNase I消化并純化后再用于本試劑盒。

3. 使用前，磁珠需提前平衡至室溫。

4. RNA投入量為10 ng- 1000 ng。

5. 在操作過程種，避免EP管或PCR管管蓋開封（孵育過程中）或長時間處于室溫狀態(tài)。

6.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

7.本產(chǎn)品僅用作科研用途！

 

自備材料

1. qRT-PCR質(zhì)檢rRNA去除效率：Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)（Cat#11201）或其他等效產(chǎn)品；

2. 其他材料： 無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

 

操作步驟

1. 探針雜交

1.1 將探針、Streptavidin-coated magnetic beads和雜交Buffer從-20°C 取出，解凍后顛倒混勻，探針置于冰上放置，其余試劑平衡至室溫備用。

1.2 準(zhǔn)備RNA樣品：根據(jù)投入量和樣品濃度，計算RNA取樣體積，用Nuclease free H₂O稀釋至12 μL。

1.3 按照表1于200 μL PCR管中配制rRNA去除反應(yīng)體系。

表 1 探針雜交反應(yīng)體系

名稱	體積（μL）
Hybridization Buffer	5
Probe Mix	3
Total RNA	12（10 ng~1 μg）
Total	20

1.4 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

1.5 將上述 PCR 管置于PCR儀中，按照表2所示反應(yīng)程序，進(jìn)行探針雜交反應(yīng)。

表 2 探針雜交反應(yīng)程序

溫度	時間
熱蓋105°C	On
68℃	10 min
68℃-37℃	0.1℃/s
37℃*	2 min

*注：采用梯度退火之后，需要盡快進(jìn)入下一操作步驟，嚴(yán)禁PCR程序中出現(xiàn)4℃ hold，否則會影響去除效果。
2. 鏈酶親和素磁珠準(zhǔn)備

2.1低速渦旋振蕩鏈酶親和素磁珠使磁珠重懸。

2.2 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

2.3 吸取40 μL Streptavidin-coated magnetic beads于新的PCR管中，將PCR管置于磁力架上，靜置2 min；。

2.4待溶液澄清后，去掉所有上清液。

2.5向PCR管中加入80 μL Depletion buffer后，用移液器吹打10次混勻。

2.6將PCR管置于磁力架上，靜置2 min，待溶液澄清后，去上清。

2.7向PCR管中加入80 μL Depletion buffer后，用移液器吹打10次混勻。

3. rRNA去除

3.1瞬離將步驟1中雜交樣品離心至管底。

3.2 將步驟2中的鏈酶親和素磁珠加入步驟1的樣品中，用移液器吹打10次混勻后，置于PCR儀中，按照表3所示反應(yīng)程序，進(jìn)行探針捕獲。

表3 rRNA去除反應(yīng)程序

溫度	時間
熱蓋105°C	On
37℃	15 min
50℃	5 min
*立即進(jìn)入下一步驟

*注：去除反應(yīng)程序完成后，需要盡快進(jìn)入下一操作步驟，嚴(yán)禁PCR程序中出現(xiàn)4℃ hold，否則會影響去除效果。
3.3 瞬離將反應(yīng)液離心至管底。

3.4 將樣品管置于磁力架上，靜置2 min。

3.5 待溶液澄清后，小心轉(zhuǎn)移上清至新的PCR管中。

3.6 將PCR管置于磁力架上，靜置2 min，待溶液澄清后，小心轉(zhuǎn)移上清至新的PCR管中（建議）。

4. RNA純化

4.1 準(zhǔn)備工作：將Purification beads由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。用Nuclease free H₂O配制 80%乙醇。

4.2 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

4.3 吸取 180 μL Purification beads至上一步產(chǎn)物中，移液器充分吹打混勻，室溫孵育 5 min。

4.4 將PCR管置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約3 min），小心移除上清。

4.5 保持PCR管始終置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H₂O新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec 后，小心移除上清。

4.6 重復(fù)步驟 4.5，總計漂洗兩次。用 10 μL移液器吸干凈殘留液體。

4.7 保持 PCR 管始終置于磁力架中，室溫下開蓋干燥磁珠（5~10 min）。

4.8 RNA洗脫：將PCR 管從磁力架上取下，加入 11 μL Nuclease free H₂O（或使用適合下游實驗的相應(yīng)體積Nuclease free H₂O或洗脫緩沖液），使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置 5 min。

4.9 將 PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取 10 μL上清（可根據(jù)步驟4.8選擇的實際洗脫體積進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整）至新的Nuclease free PCR 管中。

【注】洗脫后的樣品請立即進(jìn)行下游實驗，或置于-80℃存放。

Ver.CN20230316