Hifair® Advanced One Step RT-qPCR SYBR Green Kit是一款基于SYBR Green I染料進(jìn)行熒光定量的試劑盒。使用基因特異性引物，反轉(zhuǎn)錄和qPCR反應(yīng)在一管內(nèi)完成，無需反復(fù)的開蓋和移液操作，大大提高了檢測(cè)效率，并降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于RNA樣本，試劑盒采用耐熱Hifair® V Reverse Transcriptase高效合成cDNA，同時(shí)采用UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase進(jìn)行定量擴(kuò)增。在優(yōu)化的緩沖體系下，該試劑盒的檢測(cè)靈敏度針對(duì)高表達(dá)的靶標(biāo), 可以檢至0.1 pg，中等表達(dá)的靶標(biāo)，可以檢至1 pg。該試劑盒同時(shí)也適用于DNA樣本的擴(kuò)增定量。該試劑盒可實(shí)現(xiàn)不同動(dòng)植物樣本、細(xì)胞、微生物核酸的高靈敏檢測(cè)和定量。

 

組分信息

組分編號(hào)	組分名稱	11175ES20	11175ES70
11175-A	2× Hifair® Advanced SG Buffer	250 μL	2×1.25 mL
11175-B	Hifair® Advanced UH Enzyme Mix	20 μL	200 μL
11175-C	RNase free H2O	250 μL	2×1.25 mL

 

儲(chǔ)存條件

-25~-15℃避光儲(chǔ)存，有效期1年。

 

使用說明

1. 推薦反應(yīng)體系

組分	體積（μL）****	體積（μL）	終濃度
2× Hifair® Advanced SG Buffer	12.5	25	1×
Hifair® Advanced UH Enzyme Mix	1	2	-
Forward Primer (10 μM)**	0.5	1	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)**	0.5	1	0.2 μM
模板 RNA***	X	X
RNase-free ddH2O	to 25	to 50

表1反應(yīng)體系*****

** 通常引物終濃度為0.2 μM，也可根據(jù)情況在0.1-1 μM之間進(jìn)行調(diào)整。

*** 該試劑靈敏度極高，Total RNA在1 pg – 1 μg，人源樣本測(cè)試顯示最佳投入量為1 pg – 100 ng，控制Ct值整體在15-30之間為宜。

**** 推薦使用20 μL或 50 μL，以保證目的基因擴(kuò)增的有效性和重復(fù)性。

***** 請(qǐng)于超凈工作臺(tái)內(nèi)配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應(yīng)管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。

 

2. 反應(yīng)程序

循環(huán)步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
反轉(zhuǎn)錄	50℃*	6 min	1
預(yù)變性	95℃	5 min	1
擴(kuò)增反應(yīng)	95℃	15 sec	40
	60℃**	30 sec
熔解曲線	儀器默認(rèn)設(shè)置		1

表2 標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增程序

* 反轉(zhuǎn)錄溫度可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求在50-55℃之間進(jìn)行選擇。對(duì)于DNA樣本，反轉(zhuǎn)錄過程可省去。

** 特殊情況下退火/延伸溫度可根據(jù)引物Tm值進(jìn)行調(diào)整，建議使用60℃。

 

3. 適用機(jī)型

不需要Rox校正的儀器型號(hào)：

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler2.0, Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR;

Low Rox適用機(jī)型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6, 7, 12k Flex;

Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;

High Rox適用機(jī)型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus.

 

4. 引物設(shè)計(jì)技巧

1）引物最好應(yīng)設(shè)計(jì)成跨越一個(gè)外顯子-外顯子連接，其中一條擴(kuò)增引物可以潛在地跨越實(shí)際外顯子-內(nèi)含子邊界。這種設(shè)計(jì)可以減少從污染的基因組DNA中擴(kuò)增到假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。

2）引物應(yīng)具有特異性。引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測(cè)。

3）引物長(zhǎng)度一般在18~27 bp，不應(yīng)過長(zhǎng)否則導(dǎo)致其延伸溫度過高，不適于Taq DNA 聚合酶反應(yīng)。

4）引物GC含量在40%~60%，GC含量過高或過低都不利于反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃?？砂垂絋m= 4（G+C）+2（A+T）估算引物的Tm值，也可以通過軟件計(jì)算引物Tm值。

5）PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度通?？刂圃?0-300 bp,為了保證擴(kuò)增效率，在設(shè)計(jì)引物時(shí)要考慮PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度。

6）引物3′端末端盡量避免為A，引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。

7）堿基要隨機(jī)分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。

8）引物自身及引物之間避免存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3′ 端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其DG值不要過高（應(yīng)小于4.5 kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行。

 

5. 異常結(jié)果分析

1. 無Ct值出現(xiàn)

1. 采集熒光信號(hào)的步驟有誤：在退火/延伸結(jié)束采集信號(hào)；
2. 引物降解：可通過PAGE電泳檢測(cè)其完整性；
3. 模板量不足：對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從原液開始測(cè)試；
4. 模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。

2. Ct值偏大 (Ct >35)

1. 擴(kuò)增效率低：反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，引物設(shè)計(jì)存在問題，可試用三步法進(jìn)行反應(yīng)，也可適當(dāng)降低退火溫度等；
2. PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度。

3)  標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳

a.  加樣存在誤差：使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度；RNA模板推薦使用1×TE緩沖液（Cat #60143ES）進(jìn)行梯度稀釋，DNA模板推薦使用ddH₂O稀釋;

b.  標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解：應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；

c.  引物設(shè)計(jì)不佳：重新設(shè)計(jì)引物；

d.  模板中存在抑制物，或模板濃度過高。

4)  NTC有擴(kuò)增（Ct<32）

a.  引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；

b.  引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比；

c.  氣溶膠污染：擴(kuò)增產(chǎn)物泄露很容易在實(shí)驗(yàn)室中引發(fā)氣溶膠污染，一旦污染，定量檢測(cè)結(jié)果就會(huì)不準(zhǔn)確。推薦使用DNA/RNA Remover 核酸氣溶膠污染清除劑（Cat #19702ES）。

 

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

3. 加樣和配液步驟都盡量在冰上操作。

4. 每個(gè)組分在使用前都應(yīng)震蕩混勻，低速離心。