產品描述

 

天然蛋白A（Protein A）是一種發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌的細胞壁表面蛋白，天然蛋白G（Protein G）是一種分離自G型或C型鏈球菌屬的細胞表面蛋白，二者功能相似，主要通過與免疫球蛋白（Ig）的Fc區(qū)相互作用，可結合大多數(shù)哺乳動物的IgG。然而兩者結合特異性上有所不同（詳細見附錄1，蛋白A，G對不同物種Ig的結合能力總表），如蛋白G對人IgG3，大鼠IgG2a，綿羊IgG1具有很高的親和力，但蛋白A對這些Ig結合力很弱。蛋白A，蛋白G常共價偶聯(lián)在固體載體如瓊脂糖珠或丙烯酸樹脂小珠上，直接用以做免疫沉淀（IP）或者免疫共沉淀（Co-IP）來進行蛋白功能相關研究，或者直接裝在層析柱上來純化單克隆或者多克隆抗體。

本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G，不僅維持其本身的Ig親和特性，同時也去除了天然蛋白本身的非主要結合域以降低非特異性結合。本品同時將蛋白A和蛋白G共價偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠微球表面，比單獨的蛋白A或者蛋白G都有更廣的結合范圍，適合于所有蛋白A瓊脂糖珠和蛋白G瓊脂糖珠單獨可以結合的Ig，實用性更高。

 

產品性質

 

基質（Matrix）	高度交聯(lián)的4%瓊脂糖微球
配體（Ligand）	重組蛋白A/G
孔徑（Bead size）	45-165 µm
最大流速（Flowmax）	0.3 MPa,3 bar
儲存緩沖液（Buffer）	含20%乙醇的1×PBS
載量（Capacity）	約20 mg human I gG/ mL 基質
pH范圍（pH range）	3-10

 

運輸與保存方法

 

冰袋運輸。2-8℃保存，2年有效。

 

需準備試劑

 

【注】建議以下緩沖液在使用前用0.22 μm或0.45 μm濾膜過濾。

結合/洗雜緩沖液：0.15 M NaCl, 20mM Na₂HPO₄, pH7.0

洗脫緩沖液：0.1 M甘氨酸，pH 3.0

中和液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

交聯(lián)緩沖液：0.2  M 三乙醇胺，pH8.2

終止液：50 mM Tris-HCl，pH 7.5

 

使用方法

 

一、免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）:

1蛋白樣品的準備：

① 貼壁細胞：取10 cm細胞培養(yǎng)皿中的貼壁細胞，吸除細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，然后加入500 µL至2 mL細胞裂解液裂解細胞（如RIPA裂解液）；

② 懸浮細胞：離心收集細胞后，PBS洗滌1次，然后參考貼壁細胞的裂解方法進行裂解；

③ 動植物組織樣本：參考貼壁細胞使用裂解液的比例進行裂解；

【注】a）具體的裂解方法，應參考不同裂解液的詳細使用方法；b）不同量的細胞，應選用適當裂解液的用量進行裂解（如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高，可以用裂解液或PBS適當稀釋，如果蛋白樣品濃度過低，在以后的裂解過程中宜適當減少裂解液的用量），通常裂解液最終總蛋白濃度選擇在0.5-1ug/ul范圍內較合適；c）可選：細胞或組織處理時加入廣譜核酸酶Benzonase（Yeasen Cat#20125），能夠降解所有形式的DNA和RNA(單鏈、雙鏈、線形和環(huán)狀)，而無蛋白水解活性。此步操作可以降低背景，保障實驗的可重復性。

2 去除非特應性結合（可選）：

① 取0.2-1 mL 細胞或組織裂解液，蛋白量約為0.2-1 mg，加入約1 µg和免疫沉淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG和20 µL充分重懸的rProtein A/G Agarose Resin 4FF，4℃緩慢搖動30 min~2 h。

② 2500 rpm（約1000 g）離心5 min，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。

【注】 所謂種屬相同的IgG是指與后續(xù)免疫沉淀用一抗宿主相同的正常IgG。此步驟可以預先去除樣本與rProtein A/G Agarose Resin 4FF的非特異性結合，降低背景。

3 免疫沉淀：

1）抗體吸附

① 取適量rProtein A/G Agarose Resin 4FF加入到2 mL離心管中，500 rpm離心1 min，吸棄上清。

② 加入0.5 mL結合緩沖液重懸樹脂，500 rpm離心1 min，吸棄上清。繼續(xù)重復2次此操作。

③ 向上述已平衡樹脂中加入抗體溶液，重懸樹脂，室溫下輕輕翻轉離心管或置于翻轉混合儀混勻30 min后，500 rpm離心1 min，收集上清液，備用，待檢測。

④ 向上述樹脂中加入0.5 mL的洗雜緩沖液，重懸樹脂對其進行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，500 rpm離心1 min，吸棄上清。再重復2次。

2）抗體交聯(lián)（可選）

【注】如需將抗體和目標抗原復合物共同洗脫，請忽略此步驟。

① 向清洗過的樹脂中加入1 mL交聯(lián)Buffer，500 rpm離心1 min，吸棄上清。

② 再向其中加入1 mL 20 mM DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)的交聯(lián)Buffer，該試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，重懸樹脂，室溫下手動顛倒混勻或置于翻轉混合儀輕輕翻轉，促使Buffer 和樹脂充分接觸，30 min后，500 rpm離心1 min，吸棄上清。

③ 再向其中加入1 mL終止液，重懸樹脂，終止交聯(lián)反應，室溫下手動顛倒混勻或置于翻轉混合儀輕輕翻轉15 min，500 rpm離心1 min，吸棄上清。

④ 加入0.5 mL洗雜緩沖液，重懸樹脂，進行清洗，500 rpm離心1min，吸棄上清。再重復2次。

3）沉淀反應

① 抗原吸附：向上述樹脂-抗體溶液中加入含抗原的樣品，用移液器輕輕吹打使抗原與樹脂-抗體復合物分散均勻，室溫下手動顛倒混勻或置于翻轉混合儀輕輕翻轉10 min，使抗原與抗體充分結合，如結合力較弱則可在室溫下反應1 h或者在4℃下反應過夜。

② 洗雜：將上述完成抗原吸附的產物500 rpm 離心1 min，收集上清液置于冰上待檢測。向離心管中加入1 mL洗雜緩沖液，用移液器輕輕吹打使樹脂-抗體-抗原復合物分散均勻，500 rpm離心 1 min，棄上清。重復2次，最后加入1 mL洗雜液，將樹脂-抗體-抗原復合物轉移至新的離心管中，500 rpm離心1 min，吸棄上清。

4 樣品洗脫

【注】根據后續(xù)檢測的不同提供兩種洗脫方法。

1） 變性洗脫：該方法適于SDS-PAGE檢測。向上述離心管中加入25 µL 1×SDS-PAGE loading buffer 混勻，95℃加熱5 min。500 rpm 離心1 min，收集上清進行后續(xù)WB分析。