產(chǎn)品描述

 

天然蛋白G（Protein G）是一種分離自G型或C型鏈球菌屬的細(xì)胞表面蛋白，與發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁表面的蛋白A類似，主要通過與免疫球蛋白（Ig）的Fc區(qū)相互作用，結(jié)合大多數(shù)哺乳動(dòng)物的IgG，可用于多種抗體（單抗和多抗）的分離純化。在與不用的免疫球蛋白亞類的結(jié)合特性上，ProteinA 和Protein G結(jié)合性能不太一樣，相比ProteinA，   ProteinG 對(duì)牛、羊、馬等多克隆抗體有更強(qiáng)的結(jié)合力，它還可以結(jié)合不能與ProteinA很好結(jié)合的大鼠lgG、人lgG3和小鼠lgG1（詳見附錄1）。

本品使用的是基因改造后的蛋白G，不僅維持其本身的Ig親和特性，同時(shí)也去除了天然蛋白本身的非主要結(jié)合域以降低非特異性結(jié)合，rProtein G Agarose Resin 4FF以高度交聯(lián)的瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，重組Protein G為配基，具有很高的物理化學(xué)穩(wěn)定性，可以在相對(duì)較高的流速下進(jìn)行抗體的純化，適用于工業(yè)客戶。利用本品經(jīng)過一步親和層析，即可從腹水、血清和培養(yǎng)液等樣品中得到高純度的抗體，使用方便，應(yīng)用廣泛。

 

產(chǎn)品性質(zhì)

 

基質(zhì)（Matrix）	高度交聯(lián)的4%瓊脂糖微球
配體（Ligand）	重組蛋白G
孔徑（Bead size）	45-165 µm
最大流速（Flowmax）	0.3 MPa,3 bar
儲(chǔ)存緩沖液（Buffer）	含20%乙醇的1×PBS
載量（Capacity）	＞30 mg human IgG/ mL 基質(zhì)
pH范圍（pH range）	3-10

 

運(yùn)輸與保存方法

 

冰袋運(yùn)輸。2-8℃保存，2年有效。

需準(zhǔn)備試劑

【注】建議以下緩沖液在使用前用0.22 μm或0.45 μm濾膜過濾。

結(jié)合/洗雜緩沖液：0.15 M NaCl, 20mM Na₂HPO₄, pH7.0

洗脫緩沖液：0.1 M甘氨酸，pH 3.0

中和液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

 

使用方法

 

【注】上柱之前要確保樣品溶液有合適的離子強(qiáng)度和pH值，可以用結(jié)合/洗滌緩沖液對(duì)血清樣品、腹水或細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，或者樣品用結(jié)合/洗滌緩沖液透析。

1 rProtein G Agarose Resin 4FF的裝填

1）用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭，確保柱底篩板上無氣泡，關(guān)閉柱底出口，并在柱底部留出1-2 cm的去離子水。

2）將樹脂懸浮起來，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生。

3）如果使用儲(chǔ)液器，應(yīng)立即在層析柱和儲(chǔ)液器中加滿水，將進(jìn)樣分配器放置于漿液表面，連接至泵上，避免在分配器或進(jìn)樣管中產(chǎn)生氣泡。

4）打開層析柱底部出口，開起泵，使其在設(shè)定的流速下進(jìn)行。最初應(yīng)讓緩沖液緩慢流過層析柱，然后緩慢增加至最終流速， 這樣可避免液壓對(duì)所形成柱床的沖擊，避免柱床形成的不均勻。如果達(dá)不到推薦的壓力或流速，可以用所使用泵的最大流速，這樣也可以得到一個(gè)很好的裝填效果。

【注】在隨后的色譜程序中，不要超過最大裝柱流速的75%，當(dāng)柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上3倍柱床體積的去離子水。標(biāo)上柱床高度。

5）關(guān)閉泵，關(guān)閉層析柱出口。

6）如果使用儲(chǔ)液器，去除儲(chǔ)液器，將分配器至于層析柱中。

7）將分配器推向柱子至標(biāo)記的柱床高度處。允許裝柱液進(jìn)入分配器，鎖緊分配器接頭。

8）將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中，開始平衡。如果需要可以重新調(diào)整分配器。

2 樣品純化

1）平衡：用5倍柱體積的結(jié)合Buffer平衡層析柱，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護(hù)蛋白的作用。

2）上樣：將樣品加到平衡好的Protein G Agarose Resin 4FF中，保證目的蛋白與樹脂充分接觸，提高目的蛋白的回收率，收集流出液，待檢測(cè)。

3）洗雜： 用10-15倍柱體積的洗雜Buffer進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

4）洗脫： 使用 5-10 倍柱體積的洗脫Buffer，收集洗脫液，即目的蛋白組分。

5）清洗及保存：依次使用3倍柱體積的結(jié)合Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料，最后再用5倍柱體積的 20%的乙醇平衡，然后保存在等體積的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被細(xì)菌污染。

3 SDS-PAGE檢測(cè)

將純化過程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，判定其純化效果。

4 樹脂清洗

隨著一些變性物質(zhì)的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和結(jié)合載量下降，影響柱子的性能，這時(shí)需對(duì)柱子進(jìn)行清洗：

1）去除沉淀或變性物質(zhì)

① 用2倍柱體積的6M 鹽酸胍溶液進(jìn)行清洗；

② 用5倍柱體積的PBS，pH 7.4 清洗。

2）去除由于疏水性吸附造成的非特異吸附物質(zhì)

① 用3-4倍柱體積的70%乙醇或2倍柱體積的1% Triton™X-100清洗；

② 用5倍柱體積的PBS, pH 7.4 清洗。

 

注意事項(xiàng)

 

1.請(qǐng)勿冷凍保存本產(chǎn)品。

2.Protein G瓊脂糖珠使用前一定要充分顛倒若干次，使瓊脂糖珠混合均勻。

3.所有操作過程中，樣本需要在4℃或冰上操作。

4.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

5.本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

附錄1. 蛋白A，G對(duì)不同物種Ig的結(jié)合能力總表

免疫球蛋白亞型	Protein A	Protein G	免疫球蛋白亞型	Protein A	Protein G
Human IgG	++++	++++	Mouse IgG	++++	++++
Human IgG1	++++	++++	Mouse IgG1	+	++++
Human IgG2	++++	++++	Mouse IgG2a	++++	++++
Human IgG3	+	++++	Mouse IgG2b	+++	+++
Human IgG4	++++	++++	Mouse IgG3	++	+++
Human IgM	Use anti-Human IgM		Mouse IgM	Use anti-Mouse IgM
Human IgE	NR	NR	Chicken IgG (IgY)	NR	NR
Human IgA	+	NR	Cow IgG	++	++++
Human IgA1	+	NR	Goat IgG	+	++++
Human IgA2	+	NR	Goat IgG1	+	++++
Human IgD	Use anti-Human IgD		Goat IgG2	++++	++++
Rat IgG	+	++	Goat IgM	NR	NR
Rat IgG1	NR	+	Guinea Pig IgG	++++	++
Rat IgG2a	NR	++++	Guinea Pig IgG1	++++	++
Rat IgG2b	NR	+	Guinea Pig IgG2	++++	++
Rat IgG3	+	++	Hamster IgG	+	++
Sheep IgG	+	++	Horse IgG	+	++++
Sheep IgG1	+	++	Rabbit IgG	++++	+++
Sheep IgG2	+	++	Rabbit IgM	NR	NR
Sheep IgM	NR	NR	Rabbit All isotypes	+++	++
Pig IgG	+++	+++	Monkey IgG	++++	++++
Cat IgG	++++	+	Donkey IgG	++	++++
Dog IgG	++++	+
(+)= weak binding; (++)= moderate binding; (++++)= strong binding; NR= not recommended; (-)= not tested;