產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品描述
增強型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒用于檢測直接或間接標(biāo)記辣根過氧化物酶（HRP）的抗體及其關(guān)聯(lián)的抗原。其原理是，蛋白質(zhì)或核酸在電泳后轉(zhuǎn)移到印跡膜上，以一抗及HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合膜上的目的蛋白，或以HRP標(biāo)記的探針直接或間接結(jié)合膜上的核酸。洗膜后用本產(chǎn)品配制的ECL工作液，室溫孵育膜數(shù)分鐘，將印跡膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒。然后轉(zhuǎn)入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數(shù)秒到數(shù)小時，顯影定影后蛋白質(zhì)或核酸條帶可清晰顯示在X光膠片上。
本試劑盒采用了獨特的發(fā)光底物系統(tǒng)，降低曝光背景的同時引入新型的氧化劑，大大提高試劑盒的穩(wěn)定性，使其在室溫能穩(wěn)定放置一年。除用于X光片，還可直接使用熒光CCD掃描，主要用于WB檢測以及化學(xué)發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)。
翌圣為您提供Western Blot實驗整體解決方案，相關(guān)產(chǎn)品選購請參考：WB實驗系列產(chǎn)品-選購指南
產(chǎn)品組分
|
組分編號 |
組分名稱 |
產(chǎn)品編號/規(guī)格 |
|
|
36222ES60（100 mL） |
36222ES76（500 mL） |
||
|
36222-A |
A液 |
50 mL |
250 mL |
|
36222-B |
B液 |
50 mL |
250 mL |
運輸與保存方法
常溫運輸。頻繁使用可置于室溫保存，一年穩(wěn)定；長期不用，建議置于4 ºC保存延長效期。
【注】：A液（36222-A）需避光保存！
操作方法（以X光膠片為例）
1. 執(zhí)行常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、HRP標(biāo)記抗體或者HRP標(biāo)記核酸探針孵育、洗膜。
【注】：ECL發(fā)光液是HRP的顯色底物，因此檢測系統(tǒng)最終必須基于HRP酶標(biāo)記抗體或者核酸探針。
2. 最后1次洗膜的同時，新鮮配制發(fā)光工作液（推薦100-200 μL發(fā)光液/cm2膜）：分別取等體積的A液和B液，混勻備用。
【注】：取A液和B液一定要用不同的槍頭；另建議立即使用工作液，室溫放置數(shù)小時后仍可使用但靈敏度略有降低。
3. 用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液，勿使膜完全干燥。用移液器將工作液加到膜上，使之充分接觸。室溫孵育1-2 min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。
4. 用平頭鑷子夾起膜，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體，留下少量工作液，不可讓膜完全干燥。
5. 在X光膠片暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來完全包裹印跡膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白帶面向上。
6. 暗房內(nèi)取一張X光膠片至于包裹的膜上，壓片，曝光30 sec-2 min，顯影定影沖洗?！咀ⅰ浚浩毓鈺r間需根據(jù)曝光強度做相應(yīng)的調(diào)整。若是背景過高，可使用兩張X光膠片同時壓片。
其他曝光方法
如果使用CCD拍照：可以將膜放置于工作液中，開機后按照使用說明，將膜取出，進(jìn)行拍照。另外，也可以根據(jù)情況，調(diào)整機器測量參數(shù)，提高信噪比。
注意事項
1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2）轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育都需要避免氣泡，另外戴手套可以避免在膜上留下手印，保持膜的干凈。
3）長時間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。
4）某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會淬滅熒光，應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。
5）避免將多張膜置于同一個洗膜盒內(nèi)洗膜，相互吸附或摩擦可能造成很深的背景。
6）使用肉眼可見的預(yù)染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可精確確定膠片上條帶的位置和大小。
7）使用生物素-親和素系統(tǒng)，避免使用牛奶封閉，可能會導(dǎo)致背景過高。
8）金屬氧化物顆?？赡軙斐赡ど铣霈F(xiàn)顆粒狀斑點，避免使用帶有銹跡的剪刀以及鑷子，建議使用塑料的平頭鑷子。
9）疊氮化鈉（NaN3）能抑制HRP活性，若回收HRP標(biāo)記探針或者抗體應(yīng)避免使用NaN3，如必需使用勿超過0.01%。
10）本品無特殊毒性，按普通化學(xué)品處理。
11) 本產(chǎn)品僅作科研用途!
問題與解決方案
|
遇到的問題 |
原因分析 |
推薦解決方法 |
|
膠片無條帶顯現(xiàn)或者信號較弱 |
轉(zhuǎn)膜的效率低 |
提高轉(zhuǎn)膜效率，用預(yù)染Marker判斷。 |
|
抗原/抗體量少或不匹配 |
增加抗原/抗體量或選擇合適抗原/抗體 |
|
|
X光膠片有問題 |
曝光后X光譜全黑（而非透明色），則表明膠片已完全曝光，使用新的X光片 |
|
|
顯影/定影液有問題 |
可預(yù)先曝光一張膠片進(jìn)行判斷，如有問題當(dāng)換用新的顯影/定影液 |
|
|
反應(yīng)系統(tǒng)中HRP量過多 |
稀釋HRP標(biāo)記物 |
|
|
X光片背景臟 |
一抗二抗?jié)舛忍?/span> |
降低抗體濃度，延長封閉時間 |
|
抗體未清洗干凈 |
增加洗膜次數(shù) |
|
|
條帶有空斑 |
抗原以及二抗的濃度過高 |
稀釋樣品重新跑膠，也可將混合好的顯色液冰浴后，加到膜上即刻快速顯色。 |
|
帶型不規(guī)則 |
轉(zhuǎn)膜有氣泡或甲醇（對于PVDF膜）水化不均勻 |
優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件。 |
HB181130
